Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der zytotoxischen Fähigkeit von Zytokin-induzierten Killerzellen

Nehmen Sie eine Kultur von Krebszellen mit fluoreszenzmarkierten zytoplasmatischen Proteinen.

Fügen Sie zytokininduzierte Killer- oder CIK-Zellen hinzu – Effektor-T-Zellen mit natürlichen Killerzell-ähnlichen Eigenschaften – mit Anti-Tumor-Aktivität.

Natürliche Killergruppe 2, D- oder NKG2D-Rezeptoren auf den CIK-Zellen binden an stressinduzierbare Proteine auf den Krebszellen.

Die Bindung veranlasst CIK-Zellen, zytoplasmatische Körnertoxine – Perforine und Granzyme – freizusetzen.

Perforine bilden Poren in der Krebszellmembran und ermöglichen den Eintritt von Granzymen, die Caspasen aktivieren und die Apoptose induzieren.

Ernten Sie nach der Inkubation die Zellen. Fügen Sie einen fluoreszierenden Nukleinsäure-bindenden Zellviabilitätsfarbstoff hinzu.

Der Farbstoff dringt durch die geschädigte Zellmembran ein und bindet an die DNA, was zu doppelt gefärbten toten Zellen führt.

Mit einer intakten Zellmembran sind lebende Zellen undurchlässig für den Farbstoff.

Lassen Sie die Zellen durch ein Durchflusszytometer, um lebende Zellen mit einfacher Fluoreszenz und tote Zellen mit doppelter Fluoreszenz zu erkennen.

Erstellen Sie ein Streudiagramm, um den Prozentsatz toter Krebszellen zu messen und die zytotoxische Wirkung von CIK-Zellen zu quantifizieren.

Um den zytotoxischen Assay durchzuführen, werden CIK- und humane K562-Zellen mit chronischer myeloischer Leukämie co-kultiviert, indem 1 Milliliter K562-Zellen in jeder Vertiefung in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter hinzugefügt werden. Geben Sie dann 1 Milliliter Basalmedium mit oder ohne CIK-Zellen in die 6-Well-Platte, wie im Textprotokoll aufgeführt. Mischen Sie die Zellsuspensionen, indem Sie mindestens dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren.

Legen Sie die Platte für 24 Stunden in den Inkubator. Nun co-kultivieren Sie CIK- und OC-3-Zellen der Eierstöcke, indem Sie 1 Milliliter Basalmedium mit oder ohne CIK-Zellen auf die 6-Well-Platte geben, wie im Textprotokoll aufgeführt. Mischen Sie die Zellsuspensionen, indem Sie mit der Klinge im Inkubator mindestens dreimal vorsichtig 24 Stunden lang auf und ab pipettieren. Nach der Inkubation wird die CIK-K562-Zellsuspension direkt in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen geerntet.

Um sowohl die Suspension als auch die adhärenten Zellen aus den CIK-OC-3-Gruppen zu gewinnen, überführen Sie zunächst die Zellsuspension in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Mulde mit 1 Milliliter sterilem PBS. Sammeln Sie das PBS und geben Sie es in die Tube. Fügen Sie dann 0,5 Milliliter Zelldissoziationsenzymlösung hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie 1 Milliliter der Lösung aus demselben Röhrchen in die entsprechende Vertiefung und mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie mindestens dreimal mit einer sterilen 1-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren. Sammeln Sie alle Zellen in derselben Röhre. Bei 300 x g 10 Minuten zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 Milliliter sterilem PBS. Pelletieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 Minuten. Aspirieren Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern sterilem PBS.

Geben Sie 5 Mikroliter 7-AAD-Farbstoff in die Zellsuspension. Mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie mindestens dreimal mit einer sterilen 1-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren. 10 Minuten inkubieren und vor der Analyse im Dunkeln lassen.

Um den zytolytischen Fähigkeitsassay durchzuführen, mischen Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie die Vorbereitung für die Durchflusszytometrie. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Probe, um dem Experiment eine Probe und ein Rohr hinzuzufügen. Benennen Sie die Röhren wie im Textprotokoll aufgeführt.

Um ein Scatter-Gating-System für den zytolytischen Assay zu erstellen, wählen Sie zunächst Röhrchen 1 aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Dot Plot. Um ein FSC-A/SSC-A-Diagramm zu erstellen, zeichnen Sie ein rechteckiges Gate über alle Ereignisse mit einem FSC-A-Schwellenwert von mehr als 50.000, um Zellablagerungen auszuschließen. Wählen Sie den Parameter SSC-A/CFSE für das neue Punktdiagramm aus. Wählen Sie dann den Parameter 7-AAD/CFSE für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Vier-Quadranten-Tor, um die vier Teilpopulationen zu definieren.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Sample laden, um zuerst das leere Steuerelement zu analysieren. Stellen Sie die Spannung von SSC-A und FSC-A ein. Identifizieren Sie die tote Zellpopulation unter Verwendung der Parameter CFSE und 7-AAD-Kanal. Notieren Sie die Daten von mehr als 20.000 CFSE-positiven Zellen in jeder Probe. Öffnen Sie die Dateien mit den statistischen Werten jeder einzelnen Probe, um die nicht lebensfähigen Zellpopulationen zu analysieren, und exportieren Sie die Daten in Analysedateien.