JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 4:25 Min. • July 8th, 2025
In der Mikroumgebung des Krebses setzen aktivierte Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) frei, die aus extrazellulären DNA-Fasern, Histonen und granularen Proteinen bestehen und eine entscheidende Rolle bei der Krebsprogression spielen.
Um die Adhäsion von Krebszellen und -NET in vitro zu untersuchen, fügen Sie NET-Suspension zu Multi-Well-Plattenvertiefungen hinzu. Inkubieren für die Bildung von NET-Monolagen.
Entfernen Sie nach der Inkubation nicht haftende NETs.
Fügen Sie eine Proteinlösung hinzu, um freie Bindungsstellen in den Vertiefungen zu blockieren.
Pipettieren Sie fluoreszenzmarkierte Krebszellen über NET-Monoschichten.
Spezifische Oberflächenrezeptoren auf Krebszellen interagieren mit NETs und erleichtern so die Zelladhäsion.
Nach der Inkubation das Medium aus der Vertiefung der Negativkontrolle verwerfen.
Fügen Sie Desoxyribonuklease hinzu, um NETs abzubauen und die Zellen abzulösen.
Entfernen Sie Lösungen aus der Negativkontrolle und testen Sie die Vertiefungen. Verwenden Sie Puffer, um nicht adhärente Zellen zu entfernen.
Fixieren Sie die anhaftenden Krebszellen mit Formaldehyd an NETs.
Visualisieren Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop die fluoreszierenden Krebszellen, die an NETs haften.
Testwells zeigen eine signifikante Adhäsion von Krebszellen an NETs, während mit Desoxyribonuklease behandelte NETs ein reduziertes Maß an Krebszelladhäsion aufweisen.
Geben Sie 100 Mikroliter des NET-Materials in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln, um die Wells zu beschichten. Verwenden Sie 12 bis 20 Stunden später ein Mikroskop, um die Bildung einer einheitlichen Monoschicht aus zellfreien NETs am Boden der Wells zu überprüfen. Sobald die Monoschicht verifiziert wurde, saugen Sie vorsichtig alles nicht anhaftende Material aus den Vertiefungen ab und achten Sie darauf, dass die Monoschicht am Boden nicht beschädigt wird.
Dies ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens. Um eine adäquate NET-Monoschicht zu erhalten, muss man die Platte sehr vorsichtig handhaben. Geben Sie alle Reagenzien und Zellen langsam an der Seite der Vertiefungen an. Saugen Sie sehr vorsichtig an und vermeiden Sie es, den Boden der Vertiefung mit der Saugspitze zu berühren.
Nachdem das nicht anhaftende Material entfernt wurde, geben Sie vorsichtig 100 Mikroliter einer 1%igen Rinderserumalbumin-Blockierungslösung in jede Vertiefung und lassen Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Bewegen oder schütteln Sie die Platte nicht, da dies die NET-Monoschicht stören kann.
Bereiten Sie als Nächstes A549-Krebszellen vor, indem Sie sie mit Standardtechniken ernten, wenn sie zu 70 bis 80 % konfluent sind. Resuspendieren Sie die Zellen in Medium in einer Konzentration von 2 x 104 Zellen pro 100 Mikroliter. Färben Sie die Zellen mit einem Mikroliter CFSE pro Milliliter Medium und lassen Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen im Anfangsvolumen des Mediums, um eine Konzentration von 2 x 104 Krebszellen pro 100 Mikroliter Medium aufrechtzuerhalten.
Nehmen Sie die NET-beschichtete Platte und saugen Sie die Blocklösung vorsichtig an. Geben Sie dann 100 Mikroliter der Krebszellsuspension in jede Vertiefung und lassen Sie die Zellen 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid an der Platte haften.
Saugen Sie die Flüssigkeit vollständig an und geben Sie 1.000 Einheiten DNase I für 10 Minuten in einige Vertiefungen, um die NETs abzubauen. In anderen Brunnen fügen Sie 100 Mikroliter steriles Wasser pro Brunnen für 10 Minuten als Fahrzeugkontrolle hinzu. Saugen Sie anschließend die Flüssigkeit vorsichtig aus jeder Vertiefung an und waschen Sie sie mit 100 Mikrolitern PBS, um alle nicht anhaftenden A549-Zellen zu entfernen.
Aspirieren und verwerfen Sie die gesamte Lösung in den Vertiefungen, wobei nur die NETs und die anhaftenden Krebszellen am Boden verbleiben. Fügen Sie dann 100 Mikroliter einer 4%igen Formaldehydlösung pro Vertiefung hinzu, um die Zellen zu fixieren. Übertragen Sie die Platte sofort auf ein Fluoreszenzmikroskop, um den Assay abzulesen, und stellen Sie die Ergebnisse dann mit der Datenanalysesoftware grafisch dar und analysieren Sie sie.