JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 3:40 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie Leukämiezellen in Wachstumsmedien ohne stimulierende Faktoren wie Zytokine und inkubieren Sie sie.
Das Fehlen von stimulierenden Faktoren ermöglicht eine Dephosphorylierung intrazellulärer phosphorylierter Proteine und die Rückkehr in ihren ursprünglichen Zustand.
Zentrifugieren und das Medium entfernen. Resuspendieren Sie Zellen in einem Stroma-Überstand, der das Zytokin, das thymusische Stroma-Lymphopoietin oder TSLP enthält.
TSLP bindet an seinen Rezeptor auf der Leukämiezelle und löst so die Rezeptordimerisierung aus.
Dies bringt die beiden Janus-assoziierten Kinasen (JAKs) näher zusammen, was die gegenseitige Transphosphorylierung erleichtert.
Die aktivierten JAKs phosphorylieren die zytoplasmatischen Schwänze des Rezeptors und schaffen Andockstellen für den Signalwandler und Aktivator der Transkription, die STAT-Monomere.
Nach der Phosphorylierung dimerisieren sich STATs und lösen sich vom Rezeptor, um nachgelagerte zelluläre Prozesse zu regulieren.
Fixieren Sie die Zellen, um die Phosphorylierungszustände intrazellulärer Proteine aufrechtzuerhalten.
Behandeln Sie die Zellen mit einer Permeabilisierungslösung, um die Durchlässigkeit der Zellmembran zu erhöhen.
Fügen Sie fluoreszenzmarkierte Antikörper hinzu, um die phosphorylierten Proteine zu markieren.
Die durchflusszytometrische Messung des Fluoreszenzsignals korreliert mit der TSLP-induzierten STAT-Phosphorylierung.
Um den aus manipuliertem Stroma hergestellten Überstand zu validieren, tauen Sie die Überstandsproben auf, die von der Kontrolle im Zytokin-exprimierenden Stroma entnommen wurden, und legen Sie 3 Wells mit Leukämiezelllinien pro Bedingung in R20-Medium mit einer Konzentration von 2 mal 10 bis zur fünften Zellen pro Welle in einer 96-Well-Gewebekulturplatte ab. Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Phosphorylierung aus ihrer vorherigen Kultur verloren geht.
Übertragen Sie dann die Zellen aus jeder Vertiefung in einzelne 4-Milliliter-Röhrchen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Pellets in 600 Mikrolitern pro Versuchsbedingung und plattieren Sie 200 Mikroliter Zellen pro Vertiefung für jede Bedingung in dreifacher Ausfertigung. Inkubieren Sie die Zellen für den entsprechenden Zeitraum gemäß dem spezifischen kommerziellen Phospho-Assay.
Am Ende der Inkubation pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und markieren die Zellen durch Phospho-Durchflusszytometrie-Färbung gemäß dem Protokoll des Herstellers. Analysieren Sie dann die Zellen durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von durchflusszytometrischen Standardanalyseprotokollen, um zu überprüfen, ob das Zytokin im Stromaüberstand die Leukämiezellen phosphoryliert.