Visualisierung von Bakterien in Blasenbiopsieschnitten mittels Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Beginnen Sie mit einem Objektträger, der einen entparaffinisierten und rehydrierten infizierten Harnblasenbiopsie-Gewebeschnitt enthält, der uropathogene Bakterien enthält.

Einführung fluoreszenzmarkierter Universalsonden – ein komplementäres einzelsträngiges Oligonukleotid, das spezifisch für die konservierte Region der bakteriellen 16s-ribosomalen RNA oder 16s-rRNA ist.

Inkubieren Sie den Objektträger im Dunkeln bei erhöhter Temperatur, um eine optimale Hybridisierung zu erzielen.

Während der Inkubation hybridisieren die Sonden ausschließlich mit der konservierten Region auf bakterieller 16s-rRNA und verleihen den Bakterien grüne Fluoreszenz.

Nach der Hybridisierung mit einem vorgewärmten Puffer waschen, um die ungebundenen Sonden zu entfernen.

Färben Sie den Gewebeschnitt mit Hoechst-Farbstoff und Fluorophor-markierten zellulären Proteinmarkern.

Hoechst-Moleküle binden an die DNA und färben die Zellkerne blau, während Fluorophor-markierte Marker mit spezifischen Zellbestandteilen wie Muzin- und Aktinfilamenten interagieren und im Biopsieabschnitt rote Fluoreszenz verleihen.

Waschen Sie den Objektträger und fügen Sie dem Gewebeschnitt Montagemedien hinzu.

Unter einem konfokalen Mikroskop bestätigt die grüne Fluoreszenz innerhalb des roten fluoreszenztragenden Blasenbiopsieschnitts die gewebeassoziierten Bakterien.

Bereiten Sie für jede Sonde eine Befeuchtungskammer vor, indem Sie ein eingeweichtes, zerknittertes, empfindliches Arbeitstuch und steriles Wasser in das Reservoir einer P1000-Spitzenbox geben. Setzen Sie die Spitzenhalterpatrone darauf auf, da hier die Objektträger sitzen werden. Wenn die letzte Wäsche abgeschlossen ist, nehmen Sie den Objektträger aus dem Objektträgergestell und legen Sie ihn mit dem Taschentuch nach oben auf ein frisches Papiertuch. Verwenden Sie ein feines Tuch, um den Objektträger zu trocknen, und achten Sie darauf, ihn nur vorsichtig in der Nähe, aber nicht auf den Biopsieabschnitt zu tupfen, um das Wasser abzuleiten. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Rand um den Biopsieabschnitt und legen Sie den Objektträger mit der Gewebeseite nach oben in die Befeuchtungskammer.

Stellen Sie anschließend die Befeuchtungskammer in einen auf 50 Grad Celsius eingestellten Inkubator. Pipettieren Sie zwischen 50 und 150 Mikroliter der Färbelösung direkt auf das Gewebe, so dass das Rechteck, das durch den hydrophoben Rand um das Gewebe gebildet wird, gefüllt ist, und schließen Sie die Schachtel vorsichtig. Über Nacht bei 50 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Wenn der Inkubator ein Fenster hat, decken Sie es mit Alufolie ab, um eine dunkle Umgebung zu schaffen.

Nehmen Sie am nächsten Morgen die Objektträger aus den Befeuchtungskammern und entfernen Sie die verbleibende Hybridisierungslösung schnell mit einem zarten Tuch. Legen Sie dann die Objektträger in ein vertikales Färbegestell. Legen Sie das Färbegestell 10 Minuten lang in ein in Alufolie eingewickeltes Coplin-Glas mit 100 ml des vorgewärmten Waschpuffers. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch zwei weitere Male mit frischem Waschpuffer in neuen Coplin-Tiegeln.

Bereiten Sie während dieser Waschschritte die Gegenfärbung vor, indem Sie eine Stammlösung von Hoechst 33342 in Waschpuffer im Verhältnis 1 zu 1.000 verdünnen. In dasselbe Röhrchen wird Alexa-555 Weizenkeimaggglutinin in einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter und Alexa-555 Phalloidin in eine Endkonzentration von 33 Nanomolar gegeben. Bis zur Verwendung im Dunkeln lagern.

Wenn die letzte Wäsche abgeschlossen ist, nehmen Sie die Objektträger aus dem Coplin-Behälter und entfernen Sie überschüssigen Waschpuffer vorsichtig mit einem sanften Tuch. Legen Sie die Objektträger mit der Taschentuchseite nach oben auf ein Papiertuch und geben Sie zwischen 50 und 150 Mikroliter Gegenfärbung direkt auf das Gewebe, damit der hydrophobe Rand gefüllt, aber nicht überläuft. Decken Sie bis zu vier Objektträger mit einer Kryobox ab und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Legen Sie danach die Objektträger wieder in das Färbegestell und waschen Sie sie noch zweimal in Coplin-Gläsern mit frischem Waschpuffer, wobei jeder Waschgang 10 Minuten dauert. Trocknen Sie dann die Objektträger gründlich ab und legen Sie sie mit dem Taschentuch nach oben auf ein Papiertuch unter eine Kryobox. Drücken Sie einen Tropfen Eindeckmittel direkt auf das Taschentuch und legen Sie vorsichtig ein Deckglas in der richtigen Größe darauf. Drücken Sie alle Blasen vorsichtig aus und lassen Sie die abdeckbaren Dias über Nacht im Dunkeln aushärten. Versiegeln Sie am nächsten Tag die Ränder der Deckgläser zum Objektträger mit einer leichten Schicht Klarlack und lassen Sie sie 10 Minuten im Dunkeln trocknen, bevor Sie sie im Dunkeln bei 4 Grad Celsius lagern.

Wenn Sie bereit sind, die gefärbten Biopsien abzubilden, schalten Sie das konfokale Mikroskop und die mit dem Mikroskop verbundene Software ein. Beginnen Sie mit einer FISH-positiven Folie und wechseln Sie in den Computervisualisierungsmodus. Wählen Sie die Kanäle für 405, 488 und 555 aus. Stellen Sie die Lochblende mit dem längsten Wellenlängenkanal ein, der in diesem Fall 555 ist. Suchen Sie dann die aktuelle Fokusebene für die Visualisierung markierter Bakterien im 488-Kanal. Stellen Sie ohne Änderung der Fokusebene die Verstärkung, die Laserleistung und den Offset für jeden Kanal so ein, dass das Signal nicht gesättigt und der Hintergrund nicht überkorrigiert wird. Erfassen Sie das Bild in allen drei Kanälen.