JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 3:54 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Suspension von Jurkat-Zellen – T-Lymphozyten-Leukämiezellen.
Mischen Sie ein Aliquot mit einem Zellviabilitätsfarbstoff und sorgen Sie für eine ausreichende Anzahl lebender Zellen.
Legen Sie die Zellen in eine Kulturschale und wenden Sie ultraviolette C- oder UVC-Strahlung für die erforderliche Dauer an.
UVC dringt in die Zellen ein und wird von der DNA absorbiert, wobei Pyrimidin-Photoprodukte entstehen.
Nach der Bestrahlung die Zellen inkubieren. Umfangreiche UVC-vermittelte DNA-Schäden initiieren den intrinsischen Apoptoseweg und aktivieren pro-apoptotische Proteine auf der äußeren Mitochondrienmembran.
Aktivierte Proteine oligomerisieren, bilden Membranporen und setzen Cytochrom C aus dem Intermembranraum in das Zytoplasma frei.
Cytochrom C-Komplexe bilden mit der apoptotischen Protease den aktivierenden Faktor-1 und bilden einen Apoptosomenkomplex. Das Apoptosom aktiviert Caspasen, die Apoptose verursachen.
Führen Sie fluorophormarkiertes Annexin V ein, um Phosphatidylserin auf der Membran zu markieren, einen apoptotischen Zellmarker, und fügen Sie Propidiumiodid hinzu, das durch die beschädigte Membran eindringt, um die DNA zu markieren.
Bestimmen Sie mittels Durchflusszytometrie die Annexin-V-markierten frühen apoptotischen Zellen und die doppelt gefärbten späten apoptotischen Zellen.
Beginnen Sie mit der Kultivierung von Jurkat-T-Zellen in basalem Zellkulturmedium, ergänzt gemäß den Anweisungen des Manuskripts, bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Jurkat-T-Zellen sind eine Suspensionszelllinie, die durch Übergabe in vorgewärmte Kulturmedien alle drei Tage aufrechterhalten werden kann.
Bereiten Sie apoptotische Zellen vor, indem Sie sie auf 90 % Konfluenz wachsen lassen, was drei bis vier Tage nach der Passage dauert. Züchten Sie Zellen in fünf T75-Kolben, um eine ausreichende Anzahl von Zellen für dieses Protokoll zu erhalten. Sobald die Zellen fertig sind, aspiriert man den Kolben mit einem Inhalt von etwa 24 Millilitern und überträgt ihn in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Färbung und einem Hämozytometer.
Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 271 mal g für fünf Minuten pelletiert und der Überstand verworfen. Dann resuspendieren Sie die Zellen in Medien, um drei Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten. Aliquotieren Sie die Zellen in 100 x 20 Millimeter große Gewebekulturschalen, indem Sie fünf Milliliter Zellen pro Schale übertragen.
Bereiten Sie etwa neun Kulturgerichte zu. Stellen Sie eine Schale als unbelichtete Kontrolle beiseite und setzen Sie die restlichen Schalen der UV-Strahlung aus. Stellen Sie den UV-Vernetzer auf die richtige Energiestufe ein, indem Sie die Energietaste drücken und mit dem Ziffernblock "600" eingeben. Bestrahlen Sie alle Schalen mit den Zellen mit Ausnahme der Kontrolle und achten Sie darauf, dass die obere Abdeckung der Gewebekulturschale während der UV-Exposition entfernt wird.
Inkubieren Sie dann alle Schalen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für vier Stunden. Nach der Inkubation werden alle bestrahlten Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gegeben und durch Zentrifugation bei 271 mal g für fünf Minuten pelletiert. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 24 Millilitern sterilem PBS. Das Röhrchen erneut zentrifugieren und den Überstand entfernen.