Photokonversionsbasiertes Leukozyten-Tracking in bakteriell infizierten transgenen Zebrafischen

Beginnen Sie mit einer Schale, die in Agarose eingebettete, anästhesierte, transgene Zebrafischlarven enthält, die das photokonvertierbare fluoreszierende Protein in ihren Leukozyten exprimieren – phagozytären Immunzellen.

Das linke Vesikel des Otikums, das mit rot fluoreszierenden Farbstoffen markierten Bakterien vorinjiziert wurde, liegt flach am Boden der Schale an.

Innerhalb des Vesikels des Oticus verursachen vorinjizierte Bakterien eine lokale Infektion, die die Migration der Immunzellen und die Freisetzung von Chemokin auslöst und eine Infiltration der Leukozyten in das Vesikel des Oticus verursacht.

Beobachten Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop die anfängliche Rekrutierung grüner Leukozyten und die Phagozytose roter Bakterien durch Leukozyten an der Infektionsstelle.

Beleuchten Sie das otische Vesikel mit einer Wellenlänge von 405 Nanometern, wodurch das photokonvertierbare fluoreszierende Protein irreversibel von grün nach rot umgewandelt und die Leukozyten mit roter Fluoreszenz versorgt werden – was ihre eindeutige Visualisierung und präzise Verfolgung ermöglicht.

Untersuchen Sie nun die Larven bei zwei verschiedenen Wellenlängen in verschiedenen Tiefen, was die Visualisierung sowohl der photokonvertierten roten als auch der verbleibenden grünen Fluoreszenz-Leukozyten ermöglicht.

Photokonvertierte rote Leukozyten verteilen sich aus den otischen Vesikeln und verteilen sich im ganzen Körper, was die auf Photokonversion basierende Leukozytenverfolgung erleichtert.

Nach der Zubereitung von Agarose mit Tricain gemäß dem Textprotokoll auf dem Tisch des Stereomikroskops werden mit einer Transferpipette vier bis fünf anästhesierte Larven in eine Glasbodenschale gelegt. Nehmen Sie die Tricain-Agarose-Lösung aus dem 55 Grad Celsius warmen Wasserbad und lassen Sie es 1 bis 2 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen.

Entferne in der Zwischenzeit so viel Flüssigkeit wie möglich von den betäubten Larven. Anschließend die abgekühlte Agarose in die Form geben, bis etwa die Hälfte der Oberfläche bedeckt ist. Dann die Schüssel schwenken, um die Agarose zu verteilen. Nimm Larven auf, die an den Seiten der Schale geschwommen sind, und pipettiere sie zurück in die Mitte. Verwenden Sie dann unter dem Stereomikroskop eine lange Pipettenspitze, um die Larven vorsichtig wie gewünscht zu positionieren.

Um das Vesikel des Kotus darzustellen, positionieren Sie die Larven so, dass das rechte Vesikel nach oben zeigt und das linke Vesikel flach am Boden der Schale anliegt. Lassen Sie die Agarose ca. 10 Minuten abkühlen, bevor Sie die Form bewegen. Pipettieren Sie dann vorsichtig etwas Tricain und E3-Lösung auf die Agaroseschicht, um sie feucht zu halten.

Um die Proben zu visualisieren, verwenden Sie einen Z-Stapel-Scan mit 488-Nanometer- und 543-Nanometer-Lasern. Verwenden Sie die kontinuierliche Zeilenabtastung, um die Laserleistung und die Detektorverstärkung anzupassen. Stellen Sie sicher, dass keine versehentlich photokonvertierte rote Fluoreszenz vorliegt. Wählen Sie im Fenster "Bildaufnahmesteuerung" unter "Stimulus-Einstellung" das Werkzeug "Scanner verwenden" und wählen Sie "Haupt". Wählen Sie den 405-Nanometer-Laser aus und stellen Sie ihn auf 70 % Leistung ein. Definieren Sie dann mit der Option "Kreis" den interessierenden Bereich im Vesikel oticus.

Wählen Sie unter "Stimulus Start-Einstellung" die Option "Aktivierung in Serie" mit einer Voraktivierung von 1 Frame und einer Aktivierungszeit von 60.000 Millisekunden. Wählen Sie im Fenster "Aufnahmeeinstellung" unter der Überschrift "Zeitscan" zwei Minutenintervalle aus, jeweils eines für die Vor- und eines für die Nachbereitung. Starten Sie die Zeitrafferreihe, um die Photokonversion des definierten Interessenbereichs zu starten. Scannen Sie abschließend die Probe mit einem Z-Stapel und den 488- und 543-Nanometer-Lasern, um die photokonvertierte rote Fluoreszenz sowie die verbleibende grüne Fluoreszenz zu visualisieren.