Eine Technik zur magnetischen Glaspartikel-vermittelten Nukleinsäureextraktion aus Blut

Nehmen Sie ein Röhrchen mit frisch entnommenem menschlichem Blut und fügen Sie einen Lysepuffer hinzu.

Das Detergens im Puffer permeabilisiert die Zellmembran, lysiert die Zellen und setzt intrazelluläre Nukleinsäuren (NAs) und Nukleasen frei.

Chaotrope Wirkstoffe im Puffer denaturieren Nukleasen und verhindern so den Abbau von NA

.

Fügen Sie magnetische Glaspartikel oder MGPs – siliziumbeschichtete magnetische Partikel – hinzu und mischen Sie sie gründlich.

Der niedrige pH-Wert des Puffers protoniert Siliziumdioxid, wodurch eine positive Ladung auf der Oberfläche der MGPs entsteht.

Negativ geladene NAs binden elektrostatisch an die geladene Oberfläche und bilden einen NA-MGP-Komplex.

Unter einem Magnetfeld sammeln sich NA-MGP-Komplexe an der Seite der Röhre.

Entsorgen Sie den Überstand, der Zelltrümmer und Proteine enthält.

Führen Sie mehrere Waschschritte durch, indem Sie die NA-MGP-Komplexe in einem Waschpuffer resuspendieren, ein Magnetfeld anlegen, um die Komplexe aufzufangen, und den Überstand mit den verbleibenden Verunreinigungen verwerfen.

Resuspendieren Sie Komplexe in einem Elutionspuffer. Der hohe pH-Wert unterbricht die NA-MGP-Wechselwirkung und setzt die NAs frei. Die eluierten NAs sind bereit für nachgeschaltete Assays.

Um Nukleinsäuren aus dem gesammelten Blut zu reinigen, mischen Sie den Inhalt des Röhrchens erneut, indem Sie das Vakuumröhrchen 5 bis 10 Mal von Hand wenden. Gießen Sie das vorbereitete Aliquot von MGPs direkt in das Blutentnahmeröhrchen und setzen Sie dann einen neuen Deckel aus einem unbenutzten Blutentnahmeröhrchen auf das Röhrchen mit der Probe. Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass das Röhrchen fest verschlossen ist, und mischen Sie den Inhalt des Röhrchens, indem Sie es 5 bis 10 Mal wenden.

Legen Sie die Tube in die Magnethalterung und halten Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass die Tube fest verschlossen ist. Drehen Sie dann den Magnethalter mit der Röhre einige Male um, um die MGPs zu verteilen, bevor sie sich an der Seite der Röhre mit dem Magneten sammeln. Entfernen Sie den Deckel des Röhrchens und entsorgen Sie den Inhalt des Röhrchens mit einer Einwegpipette in ein 50-Milliliter-Auffangröhrchen.

Gießen Sie das vorbereitete Aliquot von WB1 direkt in das Blutentnahmeröhrchen und schließen Sie den Deckel des Röhrchens. Mischen Sie den Inhalt 5 bis 10 Mal mit der Hand. Sammeln Sie dann die Kügelchen an der Seite des Rohrs mit dem Magneten und entfernen Sie die Flüssigkeit wie zuvor. Resuspendieren Sie die Kügelchen in das vorbereitete Aliquot von WB2. Verwerfen Sie dann die Lösung und wiederholen Sie den Vorgang mit dem vorbereiteten Aliquot von WB3.

Entfernen Sie abschließend das Röhrchen aus der Magnethalterung und gießen Sie das vorbereitete Aliquot von EB direkt in das Blutentnahmeröhrchen. Setzen Sie den Deckel auf die Tube und resuspendieren Sie die MGPs, indem Sie 5 bis 10 Mal mit einem Finger klopfen. Verwenden Sie abschließend eine 1,5-Milliliter-Einwegpipette, um einen Tropfen der resuspendierten MGPs in den nachgeschalteten Reaktionsmix der Nukleinsäureamplifikation zu übertragen.