Messung der Mastzell-Exozytose über die Freisetzung von monomeren rotfluoreszierenden Neuropeptid-Y-Proteinen

Nehmen wir transfizierte Mastzellen, die NPY-mRFP exprimieren, ein Fusionsprotein, das Neuropeptid Y und monomeres rot fluoreszierendes Protein enthält, in ihren zytoplasmatischen sekretorischen Granula.

Entfernen Sie das Medium. Den kalziumhaltigen Puffer mit einem aktivierenden Reagenz, einem Calciumionophor, pipettieren und inkubieren.

Diese Ionophore induzieren den Kalziumeinstrom, erhöhen die intrazelluläre Kalziumkonzentration und mobilisieren sekretorische Granulate zur Plasmamembran.

Das Kalzium bindet an Kalzium-bindende Proteine auf der sekretorischen Körnermembran.

Weiterhin fusioniert das sekretorische Granulat mit der Plasmamembran, die durch membrangebundene Proteine vermittelt wird, was zu einer Exozytose und Freisetzung von Inhalten, einschließlich NPY-mRFP, führt.

Nach der Inkubation den freigesetzten NPY-mRFP-haltigen Überstand sammeln und auf eine schwarze Multi-Well-Platte übertragen.

Fügen Sie ein nichtionisches Detergens hinzu, um die Zellen zu lysieren und das verbleibende intrazelluläre NPY-mRFP freizusetzen.

Sammeln Sie das Zelllysat und übertragen Sie es auf die Multi-Well-Platte.

Messen Sie mit einem Fluoreszenzplatten-Reader die Fluoreszenz des Zellübers