Super-Resolution-Bildgebung der immunologischen Synapsenbildung von NK-Zellen auf einer gestützten Lipiddoppelschicht

Bereiten Sie einen Kammerobjektträger mit einer gestützten Lipiddoppelschicht (SLB) vor, die aus Phospholipiden und biotinylierten Phospholipiden besteht.

Fügen Sie blockierende Proteine hinzu, um unspezifische Wechselwirkungen zu verhindern.

Führen Sie Streptavidin ein, das an die biotinylierten Phospholipide bindet.

Fügen Sie biotinylierte, fluoreszenzmarkierte Anti-CD16-Antikörper hinzu, die an das immobilisierte Streptavidin binden.

Pipettieren Sie D-Biotin, um eine unspezifische Bindung von Streptavidin an die Zellen zu verhindern.

Führen Sie natürliche Killerzellen oder NK-Zellen ein. Die CD16-Rezeptoren auf diesen Zellen binden spezifisch an SLB-gebundene Anti-CD16-Antikörper und bilden eine immunologische Synapse.

Diese Bindung löst eine Aktin-Umlagerung und Mikrotubuli-Polarisation aus, wodurch sich schließlich Mikrocluster im Synapsenzentrum bilden, die SLB-gebundene Anti-CD16-Antikörper und CD16-Rezeptoren enthalten.

Perforinhaltige lytische Granulate polarisieren und dringen durch Aktinfilamente an der Synapse ein.

Fixieren Sie die Zellen. Permeabilisieren Sie die Membranen und SLB.

Fügen Sie fluoreszenzmarkierte Phalloidin- und Anti-Perforin-Antikörper hinzu, die an Aktinfilamente bzw. Perforin binden.

Visualisieren Sie mit einem hochauflösenden Fluoreszenzmikroskop die Verteilung von fluoreszierenden Aktinfilamenten und Perforin-positiven Granulaten an der Synapse.

Um die glasgestützte planare Lipiddoppelschicht zusammenzusetzen, bereiten Sie zunächst 100 Milliliter Piranha-Lösung vor, indem Sie 30% Wasserstoffperoxid mit Schwefelsäure im Verhältnis 1 zu 3 in einem Becherglas mischen. Legen Sie in diese Lösung zwei rechteckige #1,5-Deckgläser für 20 bis 30 Minuten. Während die Deckgläser gereinigt werden, ist ein Röhrchen mit zuvor aufbereiteten 400-mikromolaren DOPC-Lipiden und ein Röhrchen mit zuvor aufbereiteten 80-mikromolaren Biotin-PE-Lipiden zu entnehmen. Transportiere sie auf Eis zum Argontank.

Nachdem Sie ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit Argon desoxygeniert haben, fügen Sie DOPC und Biotin-PE im Verhältnis 1 zu 1 hinzu. Das spezifische Volumen variiert je nach experimentellem Bedarf, sollte jedoch mindestens 2 Mikroliter pro Stück betragen. Desoxygenieren Sie das Mischröhrchen und die einzelnen Reagenzröhrchen, bevor Sie diese wieder in den Kühlschrank stellen.

Spülen Sie die Deckgläser nach der Reinigung gründlich mit destilliertem Wasser ab. Legen Sie die Deckgläser einige Minuten lang an der Luft trocknen. Ziehen Sie dann 1,5 Mikroliter der Liposomenmischung heraus und aliquotieren Sie sie in einem einzigen Tropfen in eine der Bahnkammern eines Kammerobjektträgers. Die Verwendung von zwei Drops pro Bahn ist typisch, aber nicht notwendig.

Legen Sie nun schnell und effizient das trockene Deckglas über die Tröpfchen. Achten Sie darauf, dass die Tropfen ausreichend Abstand haben, damit sie nach dem Auflegen des Deckglases nicht miteinander verschmelzen. Achten Sie außerdem darauf, dass die Tropfen kreisförmig und gut definiert bleiben, ohne die Ränder der Kammerwände zu berühren. Drücken Sie zwischen und um jede Bahn herum fest nach unten, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen Deckglas und Schieber zu gewährleisten.

Markieren Sie die Positionen der Tropfen mit einem Markierungsstift. Führen Sie dann 100 Mikroliter wässriges 5%iges Kasein durch die Kammer, um die Doppelschicht zu blockieren. Versuchen Sie sicherzustellen, dass sich keine Blasen in der Strömungskammer befinden. Injizieren Sie dann 100 Mikroliter Streptavidin in einer Konzentration von 333 Nanogramm pro Milliliter in jede Bahn.

Nach einer 10- bis 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur waschen Sie sich, indem Sie 3 Milliliter HEPES-gepufferte Kochsalzlösung mit 1 % Humanserumalbumin durch jede Spur laufen lassen, um das überschüssige Streptavidin zu entfernen. 100 Mikroliter biotinyliertes, fluoreszenzmarkiertes Anti-CD16 werden in der zuvor bestimmten Proteinkonzentration zugegeben, wie im Textprotokoll beschrieben.

Nach einer 20- bis 30-minütigen Inkubation im Dunkeln waschen Sie erneut, indem Sie 3 Milliliter HEPES-gepufferte Kochsalzlösung mit 1 % Humanserumalbumin durch jede Spur laufen lassen. Fließen Sie dann 100 Mikroliter D-D-Biotin in einer Konzentration von 25 Nanomolaren durch die Kammer, um überschüssiges Streptavidin zu binden und so die Möglichkeit einer unspezifischen Bindung von Streptavidin an die Zellen auszuschließen.

Zählen Sie als Nächstes menschliche NK-Zellen und resuspendieren Sie sie in einer Konzentration von 500.000 pro Milliliter in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung mit 1 % humanem Serumalbumin. Waschen Sie das D-Biotin mit weiteren 3 Millilitern HEPES-gepufferter Kochsalzlösung mit 1 % Humanserumalbumin pro Bahn aus der Kammer. Sobald die Zellen in der gewünschten Konzentration resuspendiert wurden, fügen Sie jeder Bahn 100 Mikroliter hinzu. Stellen Sie die Kammer für 30 bis 60 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Nach dieser Inkubationszeit fixieren Sie die Zellen 10 bis 20 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur. Waschen Sie, indem Sie 3 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung durch jede Spur laufen lassen, um das Paraformaldehyd zu entfernen. Fügen Sie dann 400 Mikroliter Blockierungspuffer hinzu, bevor Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Als nächstes färben Sie F-Aktin und Perforin, indem Sie 200 Mikroliter verdünntes, fluoreszenzmarkiertes Phalloidin und fluoreszenzmarkierten monoklonalen Anti-Perforin-Antikörper hinzufügen. Inkubieren Sie vor dem Waschen eine Stunde lang bei Raumtemperatur, indem Sie 3 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung durch die Kammer laufen lassen. Die Kammer ist bereit für die Bildgebung.

Schalten Sie zunächst alle erforderlichen Hardwaremodule des STED-Mikroskops ein. Starten Sie die Bildanalysesoftware und aktivieren Sie sowohl die Resonanzabtastung als auch die STED-Module. Nachdem Sie diese Auswahl getroffen haben, warten Sie etwa drei bis fünf Minuten, bis die Software gestartet wird.

Klicken Sie auf die Registerkarte Konfiguration am oberen Rand des Bildschirms. Wählen Sie Laser Config aus. Schalten Sie dann das weiße Licht und die STED 592-Nanometer-Laser ein. Wählen Sie das 100X-Objektiv und richten Sie den Anregungslaserstrahl mit einem 592-Nanometer-Verarmungslaser aus. Wählen Sie das Modul Laser Config aus. Schalten Sie den 592-Verarmungslaser und den 660-Nanometer-Verarmungslaser ein.

Platzieren Sie den Objektträger auf dem Tisch über der Linse. Bringen Sie die an den abgegrenzten Doppelschichtbereich gebundenen Zellen mit der Weißlichtlampe und den Okularen in den Fokus. Kehren Sie dann zur Registerkarte "Erfassung" direkt rechts neben der Registerkarte "Konfiguration" zurück. Klicken Sie auf die Registerkarte Zu weißem Licht wechseln, aktivieren Sie das Modul, und ziehen Sie die Anregungslaserlinie auf die entsprechende Wellenlänge.

Nachdem Sie den gewünschten Detektor ausgewählt und den Erfassungsbereich eingestellt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Sequenziell in der linken Acquire-Symbolleiste, um das Dialogfeld für sequenzielles Scannen unten in der linken Symbolleiste aufzurufen. Auf diese Weise kann der Benutzer mehrere Sequenzen hinzufügen, jede mit einem anderen Anregungsstrahl für eine andere Farbe. Klicken Sie zwischen den Frames und legen Sie dann die Anregungsfrequenz, den Detektor und den Erkennungsbereich für jede weitere Farbe fest. Sobald alle Einstellungen optimiert sind, klicken Sie auf Start, um den Akquisitionsprozess zu starten.