JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 4:26 Min. • July 8th, 2025
Beginnen wir mit einer resezierten menschlichen Lunge.
Führen Sie einen Silikonschlauch in den Hauptbronchus der Lunge ein. Sichern Sie den Schlauch und bieten Sie einen Weg für die Einführung von Agarose in das Gewebe in den nachfolgenden Schritten.
Klemmen Sie andere Bronchien und Gefäße ab, um ein Austreten von Agarose während der Befüllung zu verhindern.
Führen Sie vorgewärmte, niedrig gelierende Agarose, gemischt mit Medien, in die Lunge ein, bis sie vollständig aufgeblasen ist.
Legen Sie die Lunge zur Agarosepolymerisation auf Eis, wodurch eine feste Gelmatrix gebildet wird, die dem Gewebe Stabilität verleiht und die Lungenarchitektur während der Schnittverfahren aufrechterhält.
Schneiden Sie das Lungengewebe nach der Polymerisation in gleichmäßige Platten. Extrahieren Sie zylindrische Gewebekerne aus den Gewebeplatten.
Schneiden Sie den Gewebekern mit einem mit gekühltem Puffer gefüllten Gewebeschneider in Scheiben, um präzise geschnittene Lungenscheiben zu erhalten.
Übertragen Sie die Scheiben auf eine Kulturplatte mit gekühltem Medium. Inkubieren, um das Gewebe zu stabilisieren.
Übertragen Sie schließlich die Scheiben in eine Multiwell-Platte mit dem Medium. Die vorbereiteten, präzisionsgeschnittenen Lungenschnitte stehen nun für Experimente bereit.
Um diesen Vorgang zu beginnen, kanülieren Sie die Luftröhre, indem Sie den Silikonschlauch einführen und ihn mit einer Klemme parallel zum Schlauch fixieren, so dass die Klemme das Gewebe entlang des Silikonschlauchs zusammendrückt, ohne ihn abzuklemmen. Alle anderen Bronchien, Blutgefäße und Verletzungen mit Klammern verschließen, damit während des Füllvorgangs keine Agarose austreten kann.
Für die Kanülierung des Hauptbronchus sind gute anatomische Kenntnisse erforderlich. Die Lunge sollte nicht zu stark ausgedehnt werden, da sonst das Gewebe ablenkt, und wenn das Gewebe nicht ausreichend gefüllt ist, ist es unmöglich, PCLS zu machen, da das Gewebe zu weich ist.
Mischen Sie dann ein äquivalentes Volumen von 3 % niedrig gelierender Agarose mit Kulturmedium in einem Becherglas und träufeln Sie die Mischung mit einer 50-Milliliter-Spritze in die Lunge. Bevor Sie die Spritze wieder mit Medium befüllen, klemmen Sie den Katheter mit den Fingern oder einer Klemme zu, um Luftblasen und agarosefreies Flussmittel zu vermeiden. Schneiden Sie das Lungengewebe in 3 bis 5 Zentimeter große Platten.
Füllen Sie den Tissue Slicer mit 400 Millilitern eiskaltem EBSS. Schneiden Sie sofort die zylindrischen Gewebekerne mit einem halbautomatischen Schraubendreher mit einem Entkernungswerkzeug aus den Lungenplatten heraus. Übertragen Sie anschließend die Gewebekerne in den Gewebehalter des Tissue Slicers. Legen Sie das Gewicht auf den Gewebekern und beginnen Sie, den Gewebekern in PCLS zu schneiden. Das Medium sollte aus dem Tissue-Slicer in ein Becherglas abgelassen werden, indem die Klemme des Glaszylinders geöffnet wird.
Übertragen Sie anschließend die Scheiben aus einem Becherglas in die Petrischale mit Nährmedium. Stellen Sie anschließend die Petrischale in einen Inkubator und lassen Sie das Medium vor den Waschschritten erwärmen. Übertragen Sie dann die Lungenscheiben vorsichtig in eine 24-Well-Kulturplatte mit mindestens 500 Mikrolitern Kulturmedium für zwei Scheiben pro Well.