Ein Assay zur Messung der chemisch induzierten Zytotoxizität in präzisionsgeschnittenen Lungenscheiben von Menschen

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit menschlichen, präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten, die die native Lungenmikroarchitektur beibehalten

.

Entfernen von Medien. Steigende Prüfmittelkonzentrationen in die Vertiefungen geben und inkubieren.

Abhängig von seinem zytotoxischen Potenzial stört das Testmittel die Zellmembranen, induziert den Zelltod und reduziert lebensfähige Zellen in den Schnitten.

Nach der Inkubation Medien entfernen. Tauchen Sie die Scheiben in Medien, die wasserlösliches Tetrazoliumsalz (WST-1) und ein Elektronenkupplungsreagenz enthalten.

ausbrüten. In stoffwechselaktiven Zellen überträgt das Elektronentransportsystem der Plasmamembran Elektronen vom intrazellulären NADH auf das extrazelluläre Elektronenkupplungsreagenz, wodurch der zellundurchlässige Farbstoff WST-1 zu stabilem, dunkelgelbem, wasserlöslichem Formazan reduziert wird.

Schütteln Sie die Platte nach der Inkubation, um das Formazan gleichmäßig zu verteilen, und geben Sie es auf eine Multi-Well-Platte.

Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Absorption von Formazan, die auf die Lebensfähigkeit des Gewebes hinweist.

Eine Abnahme der Formazan-Absorption, abhängig von der Konzentration des Prüfmittels, deutet auf eine verminderte Lebensfähigkeit der Lungenscheiben hin, was die Zytotoxizität des Prüfmittels bestätigt.

Um einen Mastermix der Arbeitslösung herzustellen, verdünnen Sie 25 Mikroliter des WST-1-Reagenzes und 225 Mikroliter Medium für jede Vertiefung. Pipettieren Sie anschließend 250 Mikroliter der Mastermix-Arbeitslösung von WST-1 für jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass die PCLS während der Inkubation vollständig mit dem WST-1-Reagenz bedeckt sind.

Stellen Sie die Platte anschließend bei 200 U/min auf einen Orbitalschüttler und schütteln Sie sie vorsichtig 30 Sekunden lang, um eine gründliche Durchmischung des WST-1-Reagenzes zu gewährleisten. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter des Überstands aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte in Duplikaten auf eine neue 96-Well-Platte mit flachem Boden. Messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei 450 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader und subtrahieren Sie die Absorption bei 630 Nanometern von der bei 450 Nanometern.