Filtratproteinkonzentration in Bakterienkulturen mit einem Ultrafiltrationsgerät
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 2:49 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine großvolumige Zentrifugalfiltervorrichtung, die vertikal regenerierte Zellulosemembranen einer geeigneten Porengröße enthält.
Puffer und Zentrifuge hinzufügen. Entfernen Sie den Durchfluss, der das Membranfeuchthaltemittel enthält.
Beladen Sie das Gerät mit Bakterienkultur-Filtratprotein (CFP), das lösliche Proteine und extrazelluläre Vesikel (EVs) umfasst – nanoskalige lipidgebundene Strukturen, die von Bakterien sezernierte Biomoleküle enthalten.
Während der Zentrifugation gelangt CFP über die Zentrifugalkraft tangential durch die Membranen.
Biomoleküle, die kleiner als die Poren der Membran sind, werden mit der Kulturflüssigkeit durchdrungen, während größere, wie z. B. EVs, über die Membranoberfläche gelangen, wodurch die Verstopfung der Membran minimiert wird.
Der Filter konzentriert das CFP auf ein minimales Gerätevolumen, unterstützt durch sein Dead-Stop-Volumen, um ein Austrocknen der Biomoleküle zu verhindern.
Puffer und Zentrifuge hinzufügen.
Der Puffer ersetzt restliche Medienkomponenten, wodurch eine isotonische Umgebung für CFK-Biomoleküle geschaffen und ihre Integrität erhalten bleibt.
Setzen Sie den Konzentratbecher auf den Filterbecher, drehen Sie ihn um und zentrifugieren Sie ihn. Das konzentrierte CFP-Retentat wird für die weitere Analyse zurückgewonnen.
Bereiten Sie zunächst einen Zentrifugalfilter mit Molekulargewicht von 100 Kilodalton vor, indem Sie die volle Volumenkapazität von PBS hinzufügen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 2.800 mal g bei 4 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Durchfluss und alle verbleibenden PBS und füllen Sie die Probenkammer bis zur maximalen Kapazität mit Mtb CFP. Zentrifugieren Sie bei 2.800 mal g bei 4 Grad Celsius, bis das Volumen auf das Mindestvolumen des Ultrafiltrationsgeräts reduziert ist. Bei Bedarf wiederholen, bis die gesamte Probe ausreichend reduziert ist.
Geben Sie 1x PBS in die Filtereinheit, die das Konzentrat enthält, bis zur Gesamtkapazität des Geräts. Reduzieren Sie das Volumen wie zuvor beschrieben und wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal, um eine vollständige Reinigung und einen vollständigen Pufferwechsel zu gewährleisten. Anschließend wird das 100 Kilodalton konzentrierte CFP-Retentat oder 100R gemäß den Spezifikationen des Ultrafiltrationsgeräts zurückgewonnen. Waschen Sie den Filter mindestens dreimal mit einem Mindestvolumen von 1x PBS und ziehen Sie die Wäsche mit dem 100R, um die Rückgewinnung zu maximieren.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Anreicherung von Proteinen aus bakteriellen Kulturfiltraten (CFP) mithilfe eines Zentrifugalfiltergeräts mit großem Volumen beschrieben. Das Verfahren umfasst eine Zentrifugation zur Trennung von Biomolekülen nach Größe und ermöglicht die Gewinnung extrazellulärer Vesikel (EVs) sowie löslicher Proteine.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Biochemie
- Biotechnologie
Hintergrund
- Bakterielle Kulturfiltrate enthalten wertvolle Biomoleküle.
- Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind wichtig für die interzelluläre Kommunikation.
- Die Konzentration von CFP ist für nachgeschaltete Anwendungen unerlässlich.
- Ultrafiltrationsverfahren können die Rückgewinnung von Biomolekülen verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Anreicherung bakterieller CFP.
- Minimierung der Membranverstopfung während der Filtration.
- Erhaltung der Integrität der Biomoleküle während des Anreicherungsprozesses.
Verwendete Methoden
- Verwendung eines Zentrifugalfiltergeräts mit regenerierten Cellulosemembranen.
- Zentrifugation zur Trennung von Biomolekülen nach Größe.
- Pufferaustausch zur Erzeugung eines isotonischen Milieus.
- Mehrfache Waschschritte zur Maximierung der Ausbeute an konzentriertem CFP.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Konzentrierung von CFP mit minimalem Verlust an Biomolekülen.
- Effektive Trennung von EVs von löslichen Proteinen.
- Nachgewiesene Effizienz der Ultrafiltrationsmethode.
- Erhaltung der Integrität der konzentrierten Biomoleküle während des gesamten Prozesses.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode eignet sich zur Anreicherung bakterieller CFP.
- Die Ultrafiltration kann für verschiedene Anwendungen optimiert werden.
- Diese Technik kann die weitere Analyse bakterieller Biomoleküle erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die effiziente Anreicherung von Proteinen aus bakteriellen Kulturfiltraten, einschließlich extrazellulärer Vesikel, ist entscheidend, um eine robuste Biomarker-Entdeckung und nachfolgende translationale Forschung zu ermöglichen. Auf Ultrafiltration basierende Arbeitsabläufe unterstützen eine reproduzierbare Probenvorbereitung, die für die zuverlässige Validierung von Zielstrukturen und die Entwicklung von Assays in der Infektionsforschung unerlässlich ist. Diese Fähigkeit erhöht die Zuverlässigkeit früher biologischer Erkenntnisse und erleichtert den risikoadjustierten Fortschritt entlang der Entdeckungspipeline.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Isolierung extrazellulärer Vesikel für mechanistische Studien und die Validierung von Zielstrukturen.
- Ermöglicht die Untersuchung sekretierter bakterieller Proteine, die für Krankheitswege relevant sind.
- Unterstützt die biologische Entschärfung von Risiken, indem konzentrierte, intakte Biomoleküle für funktionelle Assays bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert reproduzierbare, konzentrierte Proteinproben für standardisierte Assayeinsätze.
- Verbessert die Empfindlichkeit und quantitative Ausgabe des Assays, indem die Variabilität der Proben minimiert wird.
- Bereitet validiertes biologisches Material für skalierbare Screening-Workflows auf.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Anreicherung diagnostischer Marker für translationsmedizinische Biomarker-Studien.
- Erhält die Integrität von Biomolekülen, um Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicherzustellen.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem hochwertige Eingabedaten für nachgeschaltete Analysen bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Ultrafiltrationsprotokoll integriert sich an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung und Assay-Entwicklung und liefert konzentrierte Proben mit hoher Integrität sowohl für mechanistische Studien als auch für translationsorientierte Forschung.
- Entdeckungsbiologie: Konzentriert sezernierte Proteine und Vesikel, um die hypothesengeleitete Target-Validierung zu unterstützen.
- Screening: Stellt reproduzierbare, quantitative Proben für die Assay-Standardisierung und Wirkstoffbewertung bereit.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative Bestimmung des Protein- und Vesikelgehalts für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Erfüllt die Anforderungen an die Anreicherung von Biomarkern für präklinische und diagnostische Studien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen standardisierten, skalierbaren Workflow zur Probenpräparation für verschiedene Forschungs- und Entwicklungsprogramme.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in der frühen Forschungsphase.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare und skalierbare Probenvorbereitung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem die Probenvariabilität reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Assets im Bereich Infektionskrankheiten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Proteinen und Vesikeln, um die Probenechtheit zu bewahren.
- Benötigt Zugang zu zentrifugalen Ultrafiltrationsgeräten und kompatibler analytischer Infrastruktur.
- Setzt eine Standardisierung über Teamgrenzen hinweg für reproduzierbare Probenvorbereitung voraus.
- Anpassbar an verschiedene bakterielle Systeme durch geeignete Membranauswahl.
- Eingeschränkt durch die Gerätekapazität und potenziellen Probenverlust, falls nicht optimiert.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026