JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 2:49 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine großvolumige Zentrifugalfiltervorrichtung, die vertikal regenerierte Zellulosemembranen einer geeigneten Porengröße enthält.
Puffer und Zentrifuge hinzufügen. Entfernen Sie den Durchfluss, der das Membranfeuchthaltemittel enthält.
Beladen Sie das Gerät mit Bakterienkultur-Filtratprotein (CFP), das lösliche Proteine und extrazelluläre Vesikel (EVs) umfasst – nanoskalige lipidgebundene Strukturen, die von Bakterien sezernierte Biomoleküle enthalten.
Während der Zentrifugation gelangt CFP über die Zentrifugalkraft tangential durch die Membranen.
Biomoleküle, die kleiner als die Poren der Membran sind, werden mit der Kulturflüssigkeit durchdrungen, während größere, wie z. B. EVs, über die Membranoberfläche gelangen, wodurch die Verstopfung der Membran minimiert wird.
Der Filter konzentriert das CFP auf ein minimales Gerätevolumen, unterstützt durch sein Dead-Stop-Volumen, um ein Austrocknen der Biomoleküle zu verhindern.
Puffer und Zentrifuge hinzufügen.
Der Puffer ersetzt restliche Medienkomponenten, wodurch eine isotonische Umgebung für CFK-Biomoleküle geschaffen und ihre Integrität erhalten bleibt.
Setzen Sie den Konzentratbecher auf den Filterbecher, drehen Sie ihn um und zentrifugieren Sie ihn. Das konzentrierte CFP-Retentat wird für die weitere Analyse zurückgewonnen.
Bereiten Sie zunächst einen Zentrifugalfilter mit Molekulargewicht von 100 Kilodalton vor, indem Sie die volle Volumenkapazität von PBS hinzufügen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 2.800 mal g bei 4 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Durchfluss und alle verbleibenden PBS und füllen Sie die Probenkammer bis zur maximalen Kapazität mit Mtb CFP. Zentrifugieren Sie bei 2.800 mal g bei 4 Grad Celsius, bis das Volumen auf das Mindestvolumen des Ultrafiltrationsgeräts reduziert ist. Bei Bedarf wiederholen, bis die gesamte Probe ausreichend reduziert ist.
Geben Sie 1x PBS in die Filtereinheit, die das Konzentrat enthält, bis zur Gesamtkapazität des Geräts. Reduzieren Sie das Volumen wie zuvor beschrieben und wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal, um eine vollständige Reinigung und einen vollständigen Pufferwechsel zu gewährleisten. Anschließend wird das 100 Kilodalton konzentrierte CFP-Retentat oder 100R gemäß den Spezifikationen des Ultrafiltrationsgeräts zurückgewonnen. Waschen Sie den Filter mindestens dreimal mit einem Mindestvolumen von 1x PBS und ziehen Sie die Wäsche mit dem 100R, um die Rückgewinnung zu maximieren.