Eine Größenausschlusschromatographie-Technik zur Reinigung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel

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Immunologie

0 Ansichten • 4:38 Min. • July 8th, 2025

Nehmen Sie eine Größenausschlusschromatographiesäule, die mit einer inerten Matrix aus Polysaccharidharzpartikeln gefüllt ist. Die porösen Partikel haben eine definierte Porengröße.

Spülen Sie die Säule mit einem Äquilibrierungspuffer für eine optimale Reinigung.

Fügen Sie ein konzentriertes Kulturfiltrat hinzu, das aus einer Kultur von Mycobacterium tuberculosis – einem pathogenen Bakterium – verarbeitet wurde. Das Filtrat enthält extrazelluläre Vesikel (EVs) und andere lösliche Proteine, die von den Bakterien sezerniert werden.

Elektrofahrzeuge sind heterogen große, kleine, kugelförmige Strukturen. Sie enthalten Makromoleküle und Virulenzfaktoren, die in einer Lipiddoppelschicht eingeschlossen sind.

Die Probe gelangt unter Schwerkraft in die Matrix. Fügen Sie den Puffer hinzu, um die Bewegung der Probe durch die Spalte zu ermöglichen.

Die EVs können aufgrund der geringen Porengröße nicht in das Harz eindringen und bewegen sich stattdessen durch den Zwischenpartikelraum, legen einen kürzeren Weg zurück und eluieren zuerst.

Proteine, die kleiner sind, dringen in die Poren ein, legen einen längeren Weg durch das Harz zurück und eluieren am Ende.

Sammeln Sie die Fraktionen, die EVs enthalten, für die nachgelagerte Analyse.

Lassen Sie die Größenausschlusschromatographie oder SEC-Säule auf Raumtemperatur äquilibrieren. Schalten Sie die AFC über den Netzschalter auf der Rückseite des Turmgeräts ein und drücken Sie bei Bedarf SETUP auf dem Touchscreen des Hauptmenüs, um die Einstellungen für die Wägezelle anzupassen. Richten Sie das Karussell auf dem Bildschirm SETUP aus, indem Sie KARUSSELL und dann KALIBRIEREN auswählen. Setzen Sie das Karussell mit den 13 kleinen Löchern nach oben in den AFC-Turm ein und stellen Sie das Karussell durch Drücken der Minus- oder Plus-Taste so ein, dass sich die Flüssigkeitsdüse direkt über der Spülposition befindet.

Entfernen Sie die Kappen von der äquilibrierten SEC-Säule und schieben Sie die SEC-Säule in die entsprechende Säulenhalterung. Installieren Sie es vorsichtig auf dem AFC-Turm. Stellen Sie sicher, dass das Radiofrequenz-Identifikationsetikett an der Säule zum AFC zeigt, und überprüfen Sie, ob die Verbindung zwischen der Säule und dem Ventil sicher ist. Legen Sie den Ablaufschlauch in einen Auffangbehälter. Wählen Sie auf dem Bildschirm SETUP die Option Entnahmezeitplan aus, und legen Sie die Anzahl auf 13 und die Größe auf 0,5 Milliliter fest, indem Sie die Minus- oder Plus-Tasten drücken.

Behalten Sie die Standardeinstellung für das Puffervolumen von 2,7 Millilitern bei, und schließen Sie dann das Fenster Entnahmezeitplan. Wählen Sie auf dem Startbildschirm Sammlung starten aus, und bestätigen Sie die Sammlungsparameter mit Ja. Laden Sie 13 beschriftete 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geöffneten Deckeln und in Richtung Karussellmitte zeigend. Schieben Sie den AFC voran, indem Sie OK auswählen. Montieren Sie dann das Säulenreservoir, und fahren Sie erneut fort, indem Sie OK drücken.

Wählen Sie die Option zum Leeren der Säule aus, indem Sie Ja drücken, und fügen Sie ein Säulenvolumen mit 0,2 Mikrometer gefiltertem PBS hinzu, um den Speicherpuffer zu entfernen. Sobald die Spülung abgeschlossen ist, schieben Sie den AFC voran, indem Sie OK drücken. Setzen Sie die Karussellabdeckung über den AFC und drücken Sie OK. Verwenden Sie eine Pipette, um überschüssigen Puffer aus der Säule zu entfernen. Bringen Sie 3 Milligramm 100R-Probe mit 1x PBS auf 500 Mikroliter und geben Sie die Probe an den oberen Rand der Säule.

Bereiten Sie ein Säulenvolumen mit 0,2 Mikrometer gefiltertem PBS vor. Schieben Sie den AFC vor und lassen Sie die Probe in die Fritte laufen. Sobald die Probe vollständig in die Säule gelangt ist, geben Sie das zuvor vorbereitete PBS in das Reservoir. Überwachen Sie den Lauf des AFC, während er zuerst das Void-Volumen und dann die angegebenen Brüche sammelt. Nachdem der Lauf abgeschlossen ist und das Karussell in die Abfallposition zurückkehrt, entfernen Sie die Abdeckung und die Fraktionsröhrchen vom Karussell.

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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026