Eine zWEDGI-Technik zur Visualisierung von mit Pilzerregern infizierten Zebrafischlarven

Beginnen Sie mit transgenen Zebrafischlarven, die fluoreszenzmarkierte Immunzellen exprimieren, die mit einzigartigen fluoreszierenden Markern versehen sind, um eine präzise Nachverfolgung zu ermöglichen.

Die Larven werden mit rot fluoreszierendem Protein, das Aspergillus-Sporen exprimiert, in ihr Hinterhirn vorinjiziert.

Im Hinterhirn ahmen die Pilzsporen lokale Entzündungen nach und ziehen Immunzellen, einschließlich Makrophagen, an, die Sporen phagozytieren, um sie zu beseitigen.

Während einige wenige Sporen bestehen bleiben und zu Hyphen keimen, wodurch von Krankheitserregern abgeleitete Moleküle freigesetzt und Neutrophile an den Infektionsort gelockt werden.

Übertragen Sie eine anästhesierte Larve in die mediumhaltige Ladekammer der Zebrafisch-Verwundungs- und Einfangvorrichtung für Wachstum und Bildgebung (zWEDGI), die über einen Restriktionskanal mit der Verwundungskammer verbunden ist.

Befestigen Sie die Larve im Restriktionskanal in dorsal-lateraler Ausrichtung für die Bildgebung des Hinterhirns.

Im Frühstadium stellt die rote Fluoreszenz die Pilzsporen dar, während die grüne Fluoreszenz die Rekrutierung der Makrophagen an der Infektionsstelle bestätigt.

Im Laufe der Zeit deutet die Ausbreitung der roten Fluoreszenz auf das Fortschreiten der Infektion hin, während das Auftreten zusätzlicher blauer Fluoreszenz auf die Rekrutierung von Neutrophilen hinweist.

Bereiten Sie am Tag der Bildgebung eine 3,5-Millimeter-Petrischale mit 100 mikromolaren PTU und eine mit E3-Tricain vor. Geben Sie E3-Tricain in die Kammern eines zWEDGI-Geräts und verwenden Sie eine P100-Mikropipette, um Luftblasen aus den Kammern und dem Rückhaltekanal zu entfernen, und entfernen Sie dann alle überschüssigen E3-Tricain außerhalb der Kammern.

Pipettieren Sie eine Larve hoch und geben Sie sie in die Schale mit der E3-PTU, dann übertragen Sie sie mit so wenig Flüssigkeit wie möglich auf das E3-Tricain. Nach 30 Sekunden werden die betäubten Larven in die Ladekammer der Verwundungs- und Einklemmvorrichtung überführt.

Entfernen Sie E3-Tricain aus der Verwundungskammer und geben Sie es in die Ladekammer ab, um den Schwanz der Larven in den Restriktionskanal zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass die Larve auf ihrer lateralen, dorsalen oder dorsolateralen Seite positioniert ist, damit das Hinterhirn mit einer umgekehrten Objektivlinse abgebildet werden kann.

Nachdem Sie die Larve mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet haben, geben Sie E3-Tricain in die Verwundungskammer ab, um die Larve aus dem Rückhaltekanal in die Ladekammer zu drücken. Nehmen Sie die Larve auf und geben Sie sie zurück in die Schale mit E3-Tricain, dann geben Sie sie mit so wenig Flüssigkeit wie möglich in die Schale mit E3 PTU. Spülen Sie es in PTU und geben Sie es zurück in die 48-Well-Platte.