Ein Opsono-Adhärenz-Assay zur Beurteilung der Opsonisierung von verkapselten Bakterien durch Anti-Kapsel-Antikörper

Nehmen Sie eine Suspension von chemisch abgetötetem, fluoreszenzmarkiertem Bacillus anthracis.

Die Bakterienkapsel, die hauptsächlich aus Poly-Gamma-Glutaminsäure besteht, bietet Schutz vor Phagozytose.

Nehmen Sie nicht-menschliche Primatenseren, die hitzeinaktiviert wurden, um Komplementproteine zu zerstören. Diese Seren, die von Tieren isoliert wurden, die mit einem Impfstoff auf Bakterienkapselbasis immunisiert wurden, enthalten Anti-Kapsel-Antikörper.

Geben Sie die chemisch abgetötete Bakteriensuspension in die Seren. Die Antikörper binden spezifisch an die Bakterienkapseln, erleichtern die bakterielle Opsonisierung und markieren sie für die Eliminierung durch phagozytische Zellen. Fügen Sie Standardkomplementproteine hinzu, um die Opsonisierung zu verbessern.

Übertragen Sie die opsonisierten Bakterien auf adhärente Makrophagen – phagozytische Zellen. Kurz inkubieren.

Die Antikörper und Komplementproteine auf den Bakterien binden an Makrophagen-Fc-Rezeptoren bzw. Komplementrezeptoren und fördern so die bakterielle Adhärenz.

Entfernen von Medien. Mit Puffer waschen, um nicht anhaftende Bakterien zu entfernen.

Fixieren Sie die Zellen, um die zelluläre Integrität zu erhalten.

Verwenden Sie einen fluoreszierenden Farbstoff, um die Makrophagen zu markieren.

Beobachten Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop fluoreszierende Bakterien, die an unterschiedlich fluoreszierenden Makrophagen haften, was die wirksame bakterielle Opsonisierung durch Anti-Kapsel-Antikörper bestätigt.

Waschen Sie die inaktivierte Bakterienbrühe dreimal in PBS, um das Fixiermittel zu entfernen. Geben Sie FITC-Lösung in einer Endkonzentration von 75 Mikrogramm pro Milliliter zu. Rühren Sie die Mischung langsam 18 bis 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Bakterien wie zuvor, um überschüssiges FITC zu entfernen.

Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Bazillen in PBS in der gleichen Startlautstärke. Aliquotieren Sie die Bazillen und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 Grad Celsius. Ein kleines Volumen von Testseren von nichtmenschlichen Primaten wird 30 Minuten lang bei 56 Grad Celsius in einem Wärmeblock oder einer PCR-Maschine hitzeinaktiviert. Tauen Sie FITC-markierte Bakterien mit PBS auf und waschen Sie sie zweimal, indem Sie sie drei bis fünf Minuten lang bei 15.000 g pelletieren. Resuspendieren Sie in PBS mit der gleichen Startlautstärke.

Verdünnen Sie die Testseren in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden nacheinander in Zellmedium. Geben Sie in eine weitere 96-Well-Platte mit rundem Boden 10 Mikroliter verdünnte Testseren in jede Vertiefung. Fügen Sie dann 10 Mikroliter frisch rekonstituiertes Kaninchen-Komplement hinzu.

Zu Platte Nummer drei fügen Sie das entsprechende Volumen von FITC-markierten Bazillen für eine Vielzahl von Infektionen von 20 hinzu, z. B. bei einem Volumen, das 50.000 mal 20 Bazillen für 50.000 Zellen enthält. Füllen Sie jede Vertiefung in Platte Nummer drei mit dem entsprechenden Volumen des Zellmediums auf insgesamt 105 Mikroliter auf. Inkubieren Sie Platte Nummer drei bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten in Gegenwart von 5 % CO2 mit Feuchtigkeit, um die Bazillen zu opsonisieren.

Platzieren Sie die erste Platte, die anhaftende Zellen enthält, auf einem 37 Grad Celsius heißen Block. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um verbrauchtes Medium aus den Wells zu entfernen, und ersetzen Sie es schnell durch 100 Mikroliter opsonisierte Bakterien von Platte Nummer drei, um sicherzustellen, dass während des Pipettiervorgangs keine Blasen in den Wells entstehen. Um die Zellmonoschicht nicht zu stören, fügen Sie den Seiten der Vertiefungen Volumen hinzu.

Inkubieren Sie die erste Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO₂ und Feuchtigkeit für 30 Minuten zur Adhärenz. Waschen Sie jede Mulde fünfmal mit 150 Mikrolitern PBS auf einem 37 Grad Celsius heißen Block, um nicht anhaftende Bazillen zu entfernen. Pipettieren Sie an die Seite der Vertiefungen, um sicherzustellen, dass die Zellen während des Waschens nicht versehentlich dispergiert werden. Geben Sie 150 Mikroliter 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und fixieren Sie die Zellen eine Stunde lang.

Nachdem Sie die Zellen zweimal mit PBS gewaschen haben, mischen Sie zwei Mikroliter High-Content-Screening-Orangenzellfärbung mit 10 Millilitern PBS. Geben Sie dann 150 Mikroliter dieser Färbelösung in fixierte Zellen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Platzieren Sie die erste Platte auf dem Tisch und fokussieren Sie sich mit Hellfeld- oder Phasenkontrast auf die Zellen.

Wählen Sie auf der Registerkarte "Acquisition" die Option "96-Well-Format" als Platteneinstellung und dann "Kanaleinstellungen" aus. Wählen Sie als Nächstes Einstellung auf Kachelmodus aus. Geben Sie die Anzahl der Bilder an, die erfasst werden sollen. Ändern Sie den Aufnahmemodus in Schwarzweiß oder Monochrom und stellen Sie das Binning auf mindestens 2 x 2 ein. Schalten Sie das Autofokus- oder Fokussiermodul ein. Geben Sie an, wie oft die Autofokusfunktion ausgeführt werden soll.

Aktivieren Sie als Nächstes die Z-Stack-Funktion, falls verfügbar, und geben Sie die Anzahl der Z-Stacks an, die die Dicke der Zellmonoschicht und der anhaftenden Bazillen erfassen. Legen Sie einen Dateiordner fest, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Führen Sie nun das automatisierte Imaging-Programm aus. Führen Sie die Datenerfassung und -analyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben.