Evaluierung der kontrollierten T-Zell-Aktivierung mit einem photoaktivierbaren Peptid MHC

Beginnen Sie damit, ein Deckglas mit biotinyliertem Poly-L-Lysin zu beschichten, um eine biotinreiche Oberfläche zu schaffen.

Führen Sie als Nächstes Streptavidin ein – ein Protein, das an Biotin bindet und eine molekulare Brücke für nachfolgende Wechselwirkungen bildet.

Fügen Sie danach biotinylierte photokäfigartige Peptide hinzu, die an die wichtigsten Histokompatibilitätskomplexe – pMHCs – gebunden sind, zusammen mit Adhäsionsmolekülen.

Die biotinylierten pMHC-Liganden und die Adhäsionsmoleküle interagieren mit bestimmten Regionen auf dem Streptavidin und ermöglichen deren Immobilisierung.

Waschen Sie anschließend das Deckglas wiederholt mit gepufferter Kochsalzlösung und führen Sie T-Zellen ein.

Das Vorhandensein eines Photokäfigs, einer lichtempfindlichen chemischen Gruppe, die an einen bestimmten Rest auf dem Peptid gebunden ist, behindert die spontane Bindung des T-Zell-Rezeptors an das Peptid

Für eine kontrollierte T-Zell-Aktivierung setzen Sie die photokäfigierten Peptide ultraviolettem Licht aus.

Das UV-Licht bricht die chemische Bindung zwischen dem Photokäfig-Peptid-Komplex auf und legt die native Form des Peptids frei.

T-Zell-Rezeptoren identifizieren und binden an exponierte Peptide, während Integrine an Adhäsionsmoleküle binden und die T-Zell-Aktivierung auslösen.

Beginnen Sie mit der Zugabe von biotinyliertem Poly-L-Lysin oder Bio-PLL, verdünnt 1 bis 500 in destilliertem deionisiertem Wasser, auf 8 8-Well-Kammer-Deckglas. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation mit destilliertem deionisiertem Wasser waschen und dann zwei Stunden bei Raumtemperatur trocknen.

Bio-PLL-beschichtete Oberflächen mit Blockierungspuffer bestehend aus HEPES-gepufferter Kochsalzlösung mit 2% BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockieren. Entfernen Sie nach der Inkubation den Blockierungspuffer von den bio-PLL-beschichteten Oberflächen, ohne die Vertiefungen trocknen zu lassen. Fügen Sie dann Streptavidin hinzu und inkubieren Sie bei 4 Grad Celsius.

Waschen Sie die beschichteten Oberflächen nach einer Stunde in HBS. Füllen und invertieren Sie die Vertiefungen des Kammerschiebers 4 bis 5 Mal, wobei Sie HBS aus den Vertiefungen entfernen. Lassen Sie die Vertiefungen nicht trocknen.

Fügen Sie den bio-PLL-beschichteten Oberflächen das spezifische, biotinylierte, photoaktivierbare Peptid, die Haupthistokompatibilität, die Komplexliganden und die Adhäsionsmoleküle für CD4-positive T-Zellen oder CD8-positive Zellen hinzu. Vor Licht schützen und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation wie zuvor waschen und bis zur Aussaat in HBS belassen. Fügen Sie schließlich 200.000 CD4- oder CD8-positive T-Zellen hinzu, exprimieren Sie den entsprechenden TCR in die richtigen Wells und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius haften.

Sobald sich die Zellen an der Oberfläche festgesetzt und auf ihr ausgebreitet haben, sind sie bereit für die Photoaktivierung und Bildgebung. Verwenden Sie für die Bildaufnahme ein inverses Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop, das mit einer UV-kompatiblen 150-fach-Objektivlinse ausgestattet ist. Überwachen Sie Sonden sowohl im grünen als auch im roten Kanal mit 488-Nanometer- bzw. 561-Nanometer-Anregungslasern.

Passen Sie nach der Montage des Objektträgers mit den T-Zellen die Mikroskopeinstellungen an, um bei Bedarf eine TIRF- oder Epifluoreszenzbeleuchtung zu erhalten. Wählen Sie im Live-Modus ein Zellfeld aus, das die interessierenden Fluoreszenzsonden exprimiert. Etablieren Sie mikrometergroße Regionen für die Photoaktivierung unter einzelnen Zellen mithilfe der Softwaresteuerung. Starten Sie dann die Akquisition.

In der Regel werden 80 Zeitpunkte mit einem Abstand von jeweils 5 Sekunden erfasst. Damit bleibt Zeit für sequentielle Belichtungen von 488 Nanometern und 563 Nanometern bei zweifarbigen Experimenten. Nachdem Sie 10 Zeitpunkte erfasst haben, aktivieren Sie die ausgewählten Regionen, indem Sie den digitalen Blendenverschluss für 1 bis 1,5 Sekunden öffnen. Wählen Sie nach Abschluss des Zeitraffers ein neues Zellfeld aus, und wiederholen Sie den Vorgang.