Eine in vivo Immunfluoreszenz-Lokalisierungsmethode zur Untersuchung der Antikörper-Biodistribution

Nehmen Sie ein Mausmodell von Brustkrebs. Zu den Brustdrüsentumoren gehören Krebszellen, krebsassoziierte Fibroblasten, Adipozyten, Immunzellen und Tumorgefäße.

Intravenöse Injektion von Fluorophor-konjugierten tumorspezifischen Antikörpern.

Beim Erreichen des Tumorgefäßsystems binden Antikörper an tumorspezifische Transmembranproteine auf dem Gefäßendothel und nahe gelegenen Krebszellen.

Isolieren Sie die Brustdrüse chirurgisch und tauchen Sie sie in ein Gefriermedium.

Entnehmen Sie Kryo-Schnitte auf einem Objektträger und spülen Sie sie mit einem Puffer ab, um das Gefriermedium zu entfernen.

Fixieren Sie die Abschnitte, um die Gewebearchitektur zu erhalten. Tragen Sie ein Detergens auf, um die Immunfärbung zu verbessern, und eine Blockierungslösung, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Einführung eines Primärantikörpers, der spezifisch für Adhäsionsmoleküle auf dem Blutgefäßendothel ist, und eines Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpers, der an den Primärantikörper bindet und das Gefäßsystem markiert.

Fügen Sie ein Montagemedium auf der Folie hinzu und platzieren Sie ein Deckglas.

Beurteilen Sie unter einem konfokalen Mikroskop die Bioverteilung von tumorspezifischen Antikörpern in und um das fluoreszenzmarkierte Tumorgefäßsystem.

Bereiten Sie sich nach der Anästhesie, wie im Textprotokoll beschrieben, auf die Schwanzveneninokulation der Antikörperlösungen vor. Desinfizieren Sie den Schwanz des Tieres, indem Sie ihn dreimal mit einem Alkoholtupfer abwischen. Erweitern Sie die Schwanzvenen, indem Sie sie etwa 30 Sekunden lang mit einem Wärmekissen erwärmen. Vermeiden Sie es, das gesamte Tier zu erhitzen. Führen Sie die Schmetterlingsnadel mit einem 27-Gauge-Schwanzkatheter in eine der beiden seitlichen Schwanzvenen ein.

Visualisieren Sie den Blutrückfluss in den Katheter, um sicherzustellen, dass die Nadel richtig platziert ist, damit die Lösungen vollständig in das Tier eindringen und nicht im Schwanz gefangen werden.

Befestigen Sie den Schwanz mit einem Stück chirurgischem Klebeband vorsichtig mit der eingeführten Nadel auf der Bühne. Spülen Sie den Katheter mit 25 Mikrolitern steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Injizieren Sie dann die Antikörperlösung mit Insulinspritzen in den Katheter. Spülen Sie den Katheter erneut mit 25 Mikrolitern sterilem PBS. Entferne die Nadel vom Schwanz und übe Druck aus, um Blutungen zu stoppen.

Führen Sie eine humane Euthanasie der Maus durch, wie im Textprotokoll beschrieben, und legen Sie die Maus in Rückenlage. Verwenden Sie eine chirurgische Schere und Pinzette, um Tumorgewebe zu entfernen. Verwenden Sie eine Pinzette, um nur die äußere Hautschicht zwischen den Brustdrüsen zu greifen, die dem Schwanz am nächsten sind, und machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer chirurgischen Schere. Führen Sie die geschlossene Schere in den Schnitt ein und öffnen Sie langsam die Spitze, um die Haut vorsichtig von der darunter liegenden Bauchwandmembran zu trennen und sie intakt zu halten.

Machen Sie einen vertikalen Schnitt am Bauch und trennen Sie die Haut weiter von der inneren Membran. Machen Sie zwischen der dritten und vierten Brustdrüsen einen horizontalen Schnitt quer über den Bauch, um das Zurückziehen der Haut und die Visualisierung der Brustdrüsen zu ermöglichen. Fassen Sie jeden Tumor oder jede normale Drüse mit einer Pinzette an und schneiden Sie die anhaftende Haut vorsichtig mit einer chirurgischen Schere ab.

Legen Sie herausgeschnittene Taschentücher in Einweg-Basisformen, die voretikettiert und mit Einbettmedium mit optimaler Schnitttemperatur gefüllt sind. Frieren Sie die Formen schnell ein, indem Sie sie auf Trockeneis legen. Um die Off-Target-Verabreichung zu untersuchen, entfernen Sie andere Gewebe oder Organe von Interesse. Mit einem Kryostaten werden gefrorene Gewebeblöcke mit einer Dicke von 10 Mikrometern geschnitten und benachbarte Abschnitte auf vormarkierte Adhäsionsglasobjektträger gelegt.

Spülen Sie gefrorene Gewebeobjektträger 5 Minuten lang mit PBS bei Raumtemperatur, um das Einbettungsmedium zu entfernen. Trennen Sie Gewebeschnitte mit einem hydrophoben Barrierestift, um das Volumen der während der Färbung benötigten Lösungen zu reduzieren. Fixieren Sie die Gewebeschnitte 5 Minuten lang mit 4%iger Paraformaldehydlösung. Nachdem Sie die Objektträger 5 Minuten lang in PBS gespült haben, permeabilisieren Sie Gewebeschnitte mit 0,5 % Triton X-100 in PBS für 15 Minuten. Spülen Sie die Objektträger erneut 5 Minuten lang in PBS aus.

Blockieren Sie das Gewebe 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit PBS, das 3 % Gewicht pro Volumen Rinderserumalbumin und 5 % Volumen pro Volumen Ziegenserum enthält. Nachdem Sie die Objektträger 5 Minuten lang in PBS gespült haben, inkubieren Sie die Schnitte mit Primärantikörpern, die Aufzeichnungen führen, wie z. B. einem gemeinsamen nuklearen, vaskulären oder zytoplasmatischen Marker. Hier wird Ratten-Anti-Maus-CD31 in einer Verdünnung von 1 bis 100 in der Blockierungslösung verwendet. Die Objektträger mit dem primären Antikörper werden über Nacht bei 4 Grad Celsius gelagert und vor Dehydrierung auf einer Objektträgerschale geschützt.

Spülen Sie die Objektträger nach der Inkubation dreimal 5 Minuten lang in PBS aus. Wechseln Sie den PBS jedes Mal. Inkubieren Sie die Objektträger mit Sekundärantikörpern, um die Primärantikörper zu markieren. Für diese Anwendung visualisieren Sie den Anti-B7-H3-Antikörper mit dem konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper AlexaFluor-546 und den CD31-Antikörper mit dem AlexaFluor-488-Anti-Ratten-Sekundärantikörper in Blockierungslösung. Schützen Sie die Objektträger auf einer Objektträgerschale 1 Stunde lang bei Raumtemperatur vor Licht und Austrocknung.

Nachdem Sie die Objektträger wie zuvor in PBS gespült haben, tragen Sie einen Tropfen des Eindeckmediums in die Mitte der Gewebescheibe auf. Platzieren Sie vorsichtig ein Deckglas, um das Einfangen von Luftblasen zu vermeiden. Die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack versiegeln und trocknen lassen. Fahren Sie mit der konfokalen Mikroskopie und der quantitativen Bildanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben.