Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen
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Immunologie
0 Aufrufe • 2:42 Min. • July 8th, 2025
Behüllte Viren mit Transmembran-Spike-Proteinen enthalten eine proteolytische Spaltstelle.
Membrangebundene Proteasen auf Wirtszellen spalten die Spike-Proteine und legen Fusionspeptide frei, die den Eintritt des Virus erleichtern.
Nehmen Sie zunächst Wildtyp-Peptide mit der kanonischen Spaltstelle und Variantenpeptide, die jeweils eine einzigartige Mutation an der Stelle tragen.
Die fluorogenen Peptide enthalten ein Fluorophor und einen Quencher. Aufgrund der Nähe absorbiert der Quencher die Fluoreszenz des Fluorophors.
Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte auf Eis, die Assay-Puffer und Wirtsproteasen enthält.
Geben Sie die Wildtyp- und Variantenpeptide in separate Vertiefungen. Inkubieren Sie bei einer geeigneten Temperatur für eine optimale Proteaseaktivität.
Die Protease spaltet die Peptide, trennt den Quencher vom Fluorophor und ermöglicht dessen Fluoreszenzemission.
Messen Sie die Änderung des Fluoreszenzsignals, um die Geschwindigkeit der proteolytischen Spaltung zu bestimmen.
Eine höhere Rate für die Wildtyp-Sequenz deutet auf eine höhere proteolytische Aktivität hin, während eine niedrigere Rate für die Varianten auf eine veränderte Spaltungseffizienz hinweist.
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