Warum ist die Nullhypothesenprüfung für die Target-Validierung in Protease-Assays wichtig?

Die Nullhypothesentestung ermittelt, ob beobachtete Unterschiede in den Spaltraten zwischen Wildtyp- und Varianten-Peptiden statistisch signifikant sind, und unterstützt damit fundierte Entscheidungen bei der Zielvalidierung.

Wie passt die Isolierung der unabhängigen Variablen in die Entdeckungspipeline für die Protease-Screening-Analyse ein?

Die Isolierung der Peptidsequenz als unabhängige Variable ermöglicht eine klare Zuordnung der Änderungen der Fluoreszenz zu spezifischen Mutationen an der Protease-Spaltstelle.

Welche quantitativen abhängigen Variablenmessungen ermöglichen die Untersuchung der proteolytischen Aktivität?

Die Messung der Fluoreszenzintensität über die Zeit liefert eine quantitative abhängige Variable, die direkt die Rate des proteolytischen Schnitts und die Trennung von Fluorophor und Quencher widerspiegelt.

Warum sind Replikationsanforderungen für die Zusammenarbeit über Fachbereiche hinweg bei der Entwicklung von Protease-Assays wichtig?

Technische Replikate gewährleisten die Zuverlässigkeit des Assays und ermöglichen es Entwicklungs-, Screening- und präklinischen Teams, Daten mit Vertrauen in die Reproduzierbarkeit zu vergleichen.

Welche statistischen Analysefähigkeiten sind erforderlich, bevor man diesen Protease-Spaltungs-Assay durchführt?

Der Test erfordert die Fähigkeit, Änderungen der mittleren Fluoreszenz, Standardabweichungen und p-Werte zu berechnen, um die statistische Signifikanz von Unterschieden in den Spaltungsraten zwischen Peptidvarianten zu bewerten.

Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 Ansichten • 2:42 Min. • July 8th, 2025

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Behüllte Viren mit Transmembran-Spike-Proteinen enthalten eine proteolytische Spaltstelle.

Membrangebundene Proteasen auf Wirtszellen spalten die Spike-Proteine und legen Fusionspeptide frei, die den Eintritt des Virus erleichtern.

Nehmen Sie zunächst Wildtyp-Peptide mit der kanonischen Spaltstelle und Variantenpeptide, die jeweils eine einzigartige Mutation an der Stelle tragen.

Die fluorogenen Peptide enthalten ein Fluorophor und einen Quencher. Aufgrund der Nähe absorbiert der Quencher die Fluoreszenz des Fluorophors.

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte auf Eis, die Assay-Puffer und Wirtsproteasen enthält.

Geben Sie die Wildtyp- und Variantenpeptide in separate Vertiefungen. Inkubieren Sie bei einer geeigneten Temperatur für eine optimale Proteaseaktivität.

Die Protease spaltet die Peptide, trennt den Quencher vom Fluorophor und ermöglicht dessen Fluoreszenzemission.

Messen Sie die Änderung des Fluoreszenzsignals, um die Geschwindigkeit der proteolytischen Spaltung zu bestimmen.

Eine höhere Rate für die Wildtyp-Sequenz deutet auf eine höhere proteolytische Aktivität hin, während eine niedrigere Rate für die Varianten auf eine veränderte Spaltungseffizienz hinweist.

Bereiten Sie die entsprechenden Assay-Puffer für die Proteasen vor, wie im Textprotokoll beschrieben, und kühlen Sie die Puffer auf Eis. Legen Sie eine massive, unbehandelte 96-Well-Platte aus schwarzem Polystyrol mit flachem Boden auf Eis und eine dünne Metallplatte darunter, um die Kühlung und Stabilität zu unterstützen.

Es ist wichtig, eine schwarze Platte als Assay-Platte zu verwenden, um Fluoreszenzleckagen aus benachbarten Bohrlöchern zu verhindern.

Bereiten Sie pro Peptid drei technische Replikate pro Assay mit einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern pro Probe vor. Pipettieren Sie die entsprechende Menge des Assay-Puffers in jede Vertiefung der Assay-Platte. Geben Sie 0,5 Mikroliter Protease in jede Vertiefung. In sechs Vertiefungen gibst du 0,5 Mikroliter Puffer anstelle der jeweiligen Protease. Drei davon werden leere Kontrollen sein, und die anderen drei werden Peptidkontrollen sein.

Geben Sie 5 Mikroliter des Peptids bis zu einer Endkonzentration von 50 Mikromolaren in jede Vertiefung, mit Ausnahme der blinden Kontrollen. Geben Sie in jede der drei leeren Kontrollvertiefungen 5 Mikroliter Puffer anstelle von Peptid. Setzen Sie die Platte in den Fluoreszenzplatten-Reader ein und klicken Sie auf Start.