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>1. Entwerfen und Vorbereiten der Peptide
<ol>
	<li>Erwerben Sie die Sequenz des interessierenden Fusionsproteins aus einer öffentlichen Datenbank wie NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) oder der Viruspathogendatenbank (https://www.viprbrc.org). Wählen Sie die Proteaseerkennungsstelle vor dem Fusionspeptid und schließen Sie 2-3 Aminosäuren stromaufwärts und stromabwärts dieser Sequenz ein.</li>
	<li>Bei der Bestellung der Peptide modifizieren Sie diese mit dem FRET-Paar 7-Methoxycumarin-4-ylacetyl (MCA) am N-Terminus und N-2,4-dinitrophenyl (DNP) am C-Terminus. 
	Anmerkung: Mehrere Anbieter bieten diese Modifikationen an. Preis und Lieferzeit hängen vom Lieferanten der Wahl ab. Es gibt jedoch alternative Modifikationen, die in der Empfindlichkeit variieren und Anpassungen des Plattenlesers in Bezug auf die Wellenlängen erfordern.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Peptid gemäß den Empfehlungen des Herstellers, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren. Resuspendieren Sie beispielsweise Peptide in 70 % Ethanol bis zur Endkonzentration von 1 mM.</li>
	<li>Optional wird das Röhrchen, das das Peptid und das Lösungsmittel enthält, in ein Ultraschallbad gegeben, bis es vollständig resuspendiert ist, wenn das Peptid durch Pipettieren nicht sehr gut resuspendiert wird.</li>
	<li>Aliquotieren Sie das Peptid in lichtdämpfende oder widerstandsfähige Röhrchen, um das Peptid vor dem Ausbleichen zu schützen. Halten Sie die Aliquot-Größen klein, um mehrere Gefrier-/Auftauzyklen zu vermeiden (z. B. 100 μl). Aliquots bei -20° C lagern.</li>
</ol>
>2. Vorbereiten des Fluoreszenzplatten-Readers
<ol>
	<li>Schalten Sie den Tellerleser ein und warten Sie, bis der Selbsttest abgeschlossen ist.</li>
	<li>Öffnen Sie die Betriebssoftware auf dem angeschlossenen Computer und stellen Sie sicher, dass er mit dem Plattenleser verbunden ist.</li>
	<li>Öffnen Sie die Temperatureinstellung und stellen Sie sie auf 30 °C ein (oder die gewünschte Temperatur für eine optimale Leistung der Protease).</li>
	<li>Klicken Sie auf Steuerung | Instrument Setup zum Einrichten des Experiments.</li>
	<li>Wählen Sie "Kinetisch" aus.</li>
	<li>Wählen Sie Fluoreszenz aus.</li>
	<li>Geben Sie Anregungs- und Emissionswellenlängen ein: 330 nm bzw. 390 nm.</li>
	<li>Deaktivieren Sie die Option Automatische Abschaltung.</li>
	<li>Wählen Sie Mittele, normale Empfindlichkeit.</li>
	<li>Wählen Sie eine Laufzeit von 1 h für den Assay und wählen Sie alle 60 s eine Messung aus.</li>
	<li>Stellen Sie 5 s Mischen vor der ersten Messung und 3 Sekunden vor jeder Messung ein</li>
	<li>Wählen Sie die Wells aus, um den Assay zu lesen und zu starten.</li>
</ol>
>3. Vorbereitung des Assays
<ol>
	<li>Bereiten Sie den Assay-Puffer vor, indem Sie die entsprechenden Mengen für jeden Inhaltsstoff berechnen und hinzufügen. Für Furin stellen Sie einen Puffer her, der aus 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 5 % Triton X-100 besteht. Für Trypsin ist eine phosphatgepufferte Standardkochsalzlösung (PBS) zu verwenden. 
	Anmerkung: Volumina von 10 ml oder weniger sind ausreichend. Abhängig von der Protease(n), die im Assay verwendet wird, variiert der Puffer</li>.
	<li>Den Puffer auf Eis kalt stellen.</li>
	<li>Legen Sie die Assay-Platte auf Eis mit einer dünnen Metallplatte darunter, um die Kühlung und Stabilität zu unterstützen. Verwenden Sie eine massive schwarze 96-Well-Platte aus Polystyrol mit flachem Boden und unbehandelt. 
	Anmerkung: Es ist wichtig, schwarze Platten zu verwenden, um fluoreszierende "Leckagen" aus benachbarten Bohrlöchern zu verhindern.</li>
	<li>Berechnen Sie die geeignete Menge an Protease, die für jede Reaktion hinzugefügt werden soll, basierend auf früheren Veröffentlichungen oder experimentellen Daten. Für Furin ist 1 Einheit pro Reaktion zu verwenden, was 0,5 μl entspricht. Verwenden Sie für Trypsin 0,5 μl 160 nM TPCK-Trypsin.</li>
	<li>Pro Probe werden 3 technische Replikate pro Assay mit einem Gesamtvolumen von 100 μl pro Probe vorbereitet. 
	Anmerkung: Es wurde experimentell evaluiert, dass es keinen Unterschied macht, ob das Pipettieren unter normalen Lichtverhältnissen oder bei gedimmtem Licht durchgeführt wird. Die Peptide sollten jedoch nicht über einen längeren Zeitraum dem Licht ausgesetzt werden.</li>
	<li>Pipettieren Sie die entsprechende Menge des Assay-Puffers (94,5 μl, wie in Schritt 3.1 beschrieben) in jede Vertiefung.</li>
	<li>Gib die Protease in jede Vertiefung. Sowohl für Furin als auch für TPCK-Trypsin ist eine Dosis von 0,5 μl pro Probe zu verwenden. In 6 Vertiefungen (3 Vertiefungen für eine Blindkontrolle und 3 Vertiefungen für eine Peptidkontrolle) wird 0,5 μl Puffer anstelle der jeweiligen Protease zugegeben.</li>
	<li>Fügen Sie das Peptid bis zu einer Endkonzentration von 50 μM in jeder Vertiefung mit Ausnahme der Blindkontrolle hinzu. In diesem Fall wurde die Pipette 5 μL Peptid hergestellt, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Geben Sie 5 μl Puffer anstelle von Peptid in die Blindkontrolle. 
	Anmerkung: Mehrere Konzentrationen des Peptids wurden zunächst mit den beschriebenen Enzymkonzentrationen getestet, um sicherzustellen, dass die Enzyme gesättigt waren.</li>
	<li>Setzen Sie die Platte in den Fluoreszenzplatten-Reader ein und klicken Sie auf Start.</li>
</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="immer">
	<tbody>
		<tr>
			<td>peptide</td>
			<td>Biomatik</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furin</td>
			<td>Schnabel</td>
			<td>P8077S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, TPCK-behandelt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Artikel-Nr.: 4352157-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Nr. H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Nr. C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pbs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Gemini XPS</td>
			<td>Molekulare Bauelemente</td>
			<td>XPS (Englisch)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro 6.5.1 </td>
			<td>Molekulare Bauelemente</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well-Platte (massives schwarzes Polystyrol mit flachem Boden und unbehandelt)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3915</td> kg
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leichte Dämpfungsrohre</td>
			<td>Watson Lab</td>
			<td>131-915BL oder 131-915BR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ein fluorogener peptidspaltungsassay zum screening der proteolytischen aktivität von proteasen

Quelle: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening auf proteolytische Aktivität: Anwendungen für die Aktivierung des Coronavirus-Spike-Proteins.</a> J. Vis. (2019).
Dieses Video zeigt einen Assay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen mit fluorogenen Peptiden. Die Protease erkennt ihre Spaltstelle auf dem Peptid, spaltet es und trennt den Quencher vom Fluorophor, wodurch seine Fluoreszenzemission ermöglicht wird. Das Fluoreszenzsignal wird detektiert und analysiert, um die Spaltungseffizienz verschiedener Peptidvarianten zu überprüfen.

Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen

1. Design und Vorbereitung der Peptide

Erwerben Sie die Sequenz des interessierenden Fusionsproteins aus einer öffentlichen Datenbank wie NCBI ...

Behüllte Viren mit Transmembran-Spike-Proteinen enthalten eine proteolytische Spaltstelle.
Membrangebundene Proteasen auf Wirtszellen spalten die Spike-Proteine und legen Fusionspeptide frei, die den Eintritt des Virus erleichtern.
Nehmen Sie zunächst Wildtyp-Peptide mit der kanonischen Spaltstelle und Variantenpeptide, die jeweils eine einzigartige Mutation an der Stelle tragen.
Die fluorogenen Peptide enthalten ein Fluorophor und einen Quencher. Aufgrund der Nähe absorbiert der Quencher die Fluoreszenz des Fluorophors.
Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte auf Eis, die Assay-Puffer und Wirtsproteasen enthält.
Geben Sie die Wildtyp- und Variantenpeptide in separate Vertiefungen. Inkubieren Sie bei einer geeigneten Temperatur für eine optimale Proteaseaktivität.
Die Protease spaltet die Peptide, trennt den Quencher vom Fluorophor und ermöglicht dessen Fluoreszenzemission.
Messen Sie die Änderung des Fluoreszenzsignals, um die Geschwindigkeit der proteolytischen Spaltung zu bestimmen.
Eine höhere Rate für die Wildtyp-Sequenz deutet auf eine höhere proteolytische Aktivität hin, während eine niedrigere Rate für die Varianten auf eine veränderte Spaltungseffizienz hinweist. 

Bereiten Sie die entsprechenden Assay-Puffer für die Proteasen vor, wie im Textprotokoll beschrieben, und kühlen Sie die Puffer auf Eis. Legen Sie eine massive, unbehandelte 96-Well-Platte aus schwarzem Polystyrol mit flachem Boden auf Eis und eine dünne Metallplatte darunter, um die Kühlung und Stabilität zu unterstützen.
Es ist wichtig, eine schwarze Platte als Assay-Platte zu verwenden, um Fluoreszenzleckagen aus benachbarten Bohrlöchern zu verhindern.
Bereiten Sie pro Peptid drei technische Replikate pro Assay mit einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern pro Probe vor. Pipettieren Sie die entsprechende Menge des Assay-Puffers in jede Vertiefung der Assay-Platte. Geben Sie 0,5 Mikroliter Protease in jede Vertiefung. In sechs Vertiefungen gibst du 0,5 Mikroliter Puffer anstelle der jeweiligen Protease. Drei davon werden leere Kontrollen sein, und die anderen drei werden Peptidkontrollen sein.
Geben Sie 5 Mikroliter des Peptids bis zu einer Endkonzentration von 50 Mikromolaren in jede Vertiefung, mit Ausnahme der blinden Kontrollen. Geben Sie in jede der drei leeren Kontrollvertiefungen 5 Mikroliter Puffer anstelle von Peptid. Setzen Sie die Platte in den Fluoreszenzplatten-Reader ein und klicken Sie auf Start.

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Research

Forschung

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunologie

Immunodiagnostics

Immunodiagnostik

Specialized Assays

Spezialanalysen

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Evaluierung der proteolytischen Aktivität eine intrinsisch Niedrige Aktivität, einzelne Umsatz Protease in einem zellulären Kontext. Insbesondere wird diese Methode angewendet, um die proteolytische Aktivität des PCSK9, ein wesentlicher Bestandteil des Fettstoffwechsels zu bewerten, deren proteolytische Aktivität für ihre ultimative normalem Funktion erforderlich ist.

Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten

Hier präsentieren wir Ihnen die Einzelheiten des Verfahrens einer neu entwickelten Protease Assays Plattform nutzen N-terminalen Hexahistidine/Maltose-bindendes Protein und fluoreszierende Protein fusioniert rekombinante Substrate an der Oberfläche der Nickel-Nitrilotriacetic befestigt saure magnetische Agarose Korne. Eine anschließende Gelanalyse der Assay-Proben durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt wird ebenfalls dargestellt.

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für eine modifizierte Zymographic-Technik in der fluoreszierenden Peptide als abbaubare Substrat anstelle von native Proteine verwendet werden. Elektrophorese von biologischen Proben in fluoreszierenden Peptid-Zymogramme ermöglicht die Detektion eines breiteren Spektrums von Proteasen als frühere Zymographic Techniken.

Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

Die Protease Fluorescent Detection Kit ist für die Messung der Protease-Aktivität mit Fluorometrie konzipiert. Es eignet sich auch zum Nachweis von Spuren von Protease-Kontamination. Die Methode basiert auf der proteolytischen hydroysis von einer proprietären Rezeptur eines FITC-markiertem Casein Substrat.

Die Nutzung der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität zu bestimmen

In diesem Video führen wir Zymographie durch, eine elektrophoretische Technik, um die proteolytische Aktivität in biologischen Proben zu analysieren.

Fluoreszierende Peptid-Zymographie: Eine modifizierte Technik zum Nachweis der Proteaseaktivität unter Verwendung fluorogener Substrate in Zymogramm-Gelen

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay zur Quantifizierung der Serinproteaseaktivität von Neutrophilen in Sputumproben. Die Probe, die sezernierte Protease enthält, wird mit einem fluoreszierenden Reporter inkubiert, der ein Erkennungsmotiv trägt. Die Spaltung des Motivs durch die Protease ermöglicht eine individuelle Fluoreszenzemission durch das Donor- und Akzeptorfluorophor des Reporters, was auf die Proteaseaktivität in der Probe hinweist.

Ein In-vitro-Assay zur Messung der Serinproteaseaktivität von Neutrophilen unter Verwendung eines fluoreszierenden Reporters

Proteasen sind streng regulierte Enzyme grundlegende biologische Prozesse und Dysregulated Protease-Aktivität Laufwerke Fortschreiten von komplexen Krankheiten wie Krebs beteiligt. Diese Methode soll Nanosensoren geschaffen, die Protease-Aktivität in Vivo durch die Herstellung einer Spaltung Signal, das vom Host Urin nachweisbar ist und Krankheit diskriminiert messen.

Nanosensoren Protease-Aktivität In Vivo für die nicht-invasive Diagnostik zu erkennen

Wir präsentieren einen Fluorogenic Peptid Spaltung-Assay, der eine schnelle Screening der proteolytischen Aktivität der Proteasen auf Peptide repräsentieren die Spaltstelle virale Fusion Peptide ermöglicht. Diese Methode kann auch auf andere Aminosäure-Motiv in eine Proteinsequenz verwendet werden, für die Protease-Aktivität zu testen.

Ein Fluorogenic Peptid Spaltung Assay zum Bildschirm für die proteolytische Aktivität: Anwendungen für Coronavirus spike Protein-Aktivierung

Der Fluoreszenz-Leckage-Assay ist eine einfache Methode, die die Untersuchung von Peptid/Membran-Wechselwirkungen ermöglicht, um ihre Beteiligung an mehreren biologischen Prozessen und insbesondere die Fähigkeit von zelldurchdringenden Peptiden zu verstehen, Phospholipide-Doppelschichten während eines direkten zellulären Translokationsprozesses zu stören.

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid

Lernen Sie einen fluorogenen Peptidspaltungsassay zur Messung proteolytischer Aktivität von Proteasen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Spaltungsraten wildtypischer und mutierter Peptide.