Überwachung der Ankunft von GFP-markierten Oberflächenproteinen im trans-Golgi-Netzwerk mit funktionalisierten Nanobodies

Beginnen wir mit Krebszellen mit Sulfatmangel, die ein GFP-markiertes Oberflächenprotein exprimieren.

Fügen Sie radioaktiv markiertes Sulfat und modifizierte Anti-GFP-Nanobodies hinzu – einen einkettigen Antikörper, der ein Tyrosinsulfatierungsmotiv trägt, und inkubieren Sie.

Zellen mit Sulfatmangel internalisieren radioaktiv markierte Sulfate und bauen sie in zelluläre Komponenten ein.

Der Anti-GFP-Nanobody bindet an das GFP-markierte Oberflächenprotein und wird in ein Vesikel endozytiert. Dieses Vesikel transportiert den Nanobody-Oberflächenproteinkomplex entlang spezifischer intrazellulärer Wege, einschließlich des trans-Golgi-Netzwerks (TGN).

Innerhalb des TGN überträgt die Sulfotransferase in Gegenwart eines Substrats ein radioaktives Sulfat auf bestimmte Tyrosinreste auf dem Nanobody und markiert ihn dadurch radioaktiv

.

Waschen Sie die Zellen. Als nächstes lysieren Sie die Zellen.

Zentrifugieren Sie das Lysat, um große Zelltrümmer zu entfernen. Isolieren Sie die Nanobodies mit einer Reinigungsmethode auf Nickelkügelchenbasis.

Laden Sie die isolierte Fraktion auf ein SDS-PAGE-Gel, um den radioaktiv markierten Nanobody in verschiedene Banden zu unterteilen.

Unterziehen Sie das