Ein Assay zur Quantifizierung der Antikörper-vermittelten Phagozytose von parasiteninfizierten Erythrozyten

Nehmen Sie Plasmodium falciparum-infizierte Erythrozyten. Markieren Sie die Parasiten-DNA mit einem Fluoreszenzfarbstoff zur Visualisierung des Parasiten.

Inkubieren Sie diese mit Parasiten infizierten Erythrozyten mit Seren von Malaria-exponierten Personen. Diese Zellen weisen auf ihrer Oberfläche Parasitenantigene auf, die an natürlich erworbene humane IgG-Antikörper in Seren binden und so Zellen für die Phagozytose opsonisieren.

Übertragen Sie die opsonisierten, mit Parasiten infizierten Erythrozyten auf eine proteinbeschichtete Multi-Well-Platte, die eine Suspension von Monozyten menschlichen Ursprungs – oder phagozytären Zellen – enthält.

Während der Inkubation interagieren die Fc-gamma-Rezeptoren auf Monozyten mit den IgG-opsonisierten Erythrozyten und lösen so die Verschlingung von Erythrozyten in Phagosomen aus.

Zentrifugieren Sie die Platte nach der Inkubation, um weitere zelluläre Wechselwirkungen zu verhindern und die Phagozytose zu stoppen.

Entsorgen Sie den Überstand. Behandeln Sie mit Ammoniumchlorid-Lysinglösung, wobei nicht phagozytierte infizierte Erythrozyten selektiv aufgebrochen werden, ohne die Monozyten zu beeinträchtigen.

Fügen Sie serumhaltigen Puffer hinzu, um den Lyseprozess zu stoppen. Der Überstand mit den lysierten Erythrozyten wird zentrifugiert und verworfen.

Resuspendieren Sie die Monozyten in einem Puffer.

Durchführung einer Durchflusszytometrie zur Quantifizierung von Monozyten, die Fluoreszenz von den parasiteninfizierten Erythrozyten in ihnen aufweisen und ihre Antikörper-vermittelte Phagozytose bestätigen.

Die gereinigte infizierte Erythrozytensuspension wird um das 3,3-fache 10 auf die 7. Zellen pro Milliliter in einem Ethidiumbromid-haltigen Parasitenkulturmedium auf eine Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter eingestellt. Entfernen Sie als Nächstes die Blockierungslösung von einer 96-Well-Platte, indem Sie die Platte in einen Abfallbehälter schnippen. Entfernen Sie dann den Überschuss über einem Papiertuch und geben Sie 30 Mikroliter der mit Ethidiumbromid markierten Erythrozytensuspension in alle Vertiefungen bis auf eine Vertiefung in der oberen Hälfte der Platte. Geben Sie 30 Mikroliter Parasitenkulturmedium in die leere Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt.

Am Ende der Inkubation geben Sie 170 Mikroliter Parasitenkulturmedium in jede Vertiefung und sedimentieren die infizierten Erythrozyten durch Zentrifugation am Boden der Platte. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte in einen Abfallbehälter schnippen, und waschen Sie die mit Ethidiumbromid markierten infizierten Erythrozyten zwei weitere Male mit 200 Mikrolitern Parasitenkulturmedium pro Vertiefung, wie gerade gezeigt.

Nach dem zweiten Waschen entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig das gesamte Volumen des Überstands aus jeder Vertiefung, ohne die Pellets zu stören, und resuspendieren Sie die mit Ethidiumbromid markierten infizierten Erythrozyten in 30 Mikrolitern Antikörperlösung, einschließlich der entsprechenden Kontrollen und Testproben, die zuvor in Parasitenkulturmedium hergestellt wurden. Stellen Sie die Platte dann 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius lichtgeschützt auf.

Während die infizierten Erythrozyten opsonisiert werden, sammeln Sie die THP-1-Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 12 Millilitern frischem, vorgewärmtem THP-1-Zellkulturmedium.

Nach einer zweiten Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter THP-1-Zellkulturmedium zur Zählung und stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 mal 10 bis 5 Zellen pro Milliliter in THP-1-Zellkulturmedium ein. Entfernen Sie die Blockierungslösung aus der zweiten 96-Well-Platte und geben Sie 100 Mikroliter THP-1-Zellen in jede Vertiefung. Legen Sie dann die Platte in den Zellkultur-Inkubator.

Am Ende der Opsonisationsinkubation geben Sie 170 Mikroliter Parasitenkulturmedium in jede Vertiefung der Opsonisationsplatte und sedimentieren Sie die infizierten Erythrozyten durch Zentrifugation auf den Boden der Platte. Waschen Sie die opsonisierten, infizierten Erythrozyten zweimal mit 200 Mikrolitern Parasitenkulturmedium pro Vertiefung, indem Sie eine Mehrkanalpipette verwenden, um den Überstand nach dem zweiten Waschen vorsichtig zu entfernen.

Resuspendieren Sie die opsonisierten, infizierten Erythrozyten in 100 Mikrolitern vorgewärmtem THP-1-Zellkulturmedium pro Vertiefung und übertragen Sie 50 Mikroliter jeder opsonisierten, infizierten Erythrozytensuspension in eine entsprechende Vertiefung in der Phagozytoseplatte. Wenn alle Zellen hinzugefügt wurden, legen Sie die Platte für nicht länger als 40 Minuten lichtgeschützt in den Zellkultur-Inkubator.

Stoppen Sie am Ende der Inkubation die Phagozytose durch Zentrifugation bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets mit 150 Mikrolitern Ammoniumchlorid-Lysinglösung bei Raumtemperatur pro Vertiefung. Nach genau drei Minuten fügen Sie 100 Mikroliter eiskaltes 2%iges FBS in PBS hinzu, um die Lyse zu stoppen, und sedimentieren Sie die intakten Zellen durch Zentrifugation.

Waschen Sie die Zellen anschließend dreimal mit 200 Mikrolitern frischem, eiskaltem 2 % FBS in PBS, pro Vertiefung, pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern frischem, eiskaltem 2 % FBS in PBS pro Well.

Laden Sie für die Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie die Zellen sofort auf ein Durchflusszytometer und verwenden Sie das lineare Vorwärts- versus lineare Seitenstreudiagramm für die Vertiefungen ohne infizierte Erythrozyten, um die THP-1-Zellen zu schleusen. Erfassen Sie 10.000 Ereignisse in diesem Gate und verwenden Sie die THP-1-Zellen mit den infizierten Erythrozyten, die mit einer Positivkontrolle opsonisiert wurden, um ein Histogrammdiagramm zur Messung der Ethidiumbromid-Fluoreszenzintensität zu erstellen.

Öffnen Sie für die Analyse das Diagramm der linearen Vorwärts- und linearen Seitenstreuung für die Vertiefungen ohne infizierte Erythrozyten und gattern Sie die THP-1-Zellen. Richten Sie dann ein positives Gate in einem FL3-Histogramm ein und kopieren Sie diese Gates auf alle anderen Probenvertiefungen, um den Prozentsatz der Ethidiumbromid-positiven THP-1-Zellen zu bestimmen.