JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 2:59 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Mikrotiterplatte mit neutrophilen Serinproteasen oder NSPs. Diese löslichen Enzyme mit proteolytischer Aktivität, die von Neutrophilen sezerniert werden, wirken bei Entzündungsreaktionen.
Fügen Sie fluoreszierende Reportersonden hinzu, die ein Erkennungsmotiv tragen, das als Spaltstelle für NSPs dient. Die Sonden sind an ein Donor- und ein Akzeptorfluorophor konjugiert.
Bei Anregung durch eine bestimmte Wellenlänge gibt das Donorfluorophor Energie ab. Aufgrund seiner Nähe zum Donor absorbiert das Akzeptorfluorophor die Energie und emittiert Fluoreszenz einer anderen Wellenlänge.
Erkennen Sie die Donor- und Akzeptorsignale getrennt und berechnen Sie das Donor-zu-Akzeptor-Verhältnis, um die NSP-Aktivität zu bewerten. Ein niedriges Verhältnis deutet auf eine Quenching der Donorfluoreszenz ohne Sondenspaltung hin.
Die NSPs erkennen und spalten das Erkennungsmotiv auf den Sonden, wodurch der Akzeptor freigegeben wird.
Der Abstand zum Akzeptor ermöglicht die Fluoreszenzemission aus dem Donorfluorophor, wodurch das Donor-zu-Akzeptor-Verhältnis erhöht wird. Ein hohes Verhältnis deutet auf eine effiziente Sondenspaltung durch die NSPs hin.
Tauen Sie Enzyme auf Eis auf und stellen Sie eine Enzym-Standardkurve auf, wie im Textmanuskript beschrieben. Parallel zur Standardpräparation werden die Sputumproben in Aktivierungspuffer verdünnt. Stellen Sie am Plattenleser die Anregungswellenlänge für die NE FRET-Sonde NEmo-1 auf 354 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf 400 Nanometer für Donor und 490 Nanometer für Akzeptor ein.
Stellen Sie für die CG FRET-Sonde sSAM die Anregungswellenlänge auf 405 Nanometer und die Emission auf 485 Nanometer für Donor und 580 Nanometer für Akzeptor ein. Geben Sie 40 Mikroliter Proben, Standards oder Leerproben in die Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Halbflächenplatte und fügen Sie den Mastermix hinzu.
Starten Sie den Plattenleser und zeichnen Sie den Anstieg des Donor-Akzeptor-Verhältnisses alle 60 bis 90 Sekunden für mindestens 20 Minuten auf oder bis der Anstieg des Signals ein Plateau erreicht. Exportieren Sie die Daten und berechnen Sie das Donor-zu-Akzeptor-Verhältnis, indem Sie die Donor-RFU durch die Akzeptor-RFU für jeden Zeitpunkt und jede Probe dividieren. Berechnen Sie dann den Mittelwert und die Standardabweichung des Donor-zu-Akzeptor-Verhältnisses. Bestimmen Sie die Steigung innerhalb des linearen Wachstums der Änderung des Donor-zu-Akzeptor-Verhältnisses.