Eine mikrofluidische Chip-basierte Methode zur schnellen Chemotaxis-Analyse von Neutrophilen mit Vollblut

Fügen Sie einer Vollblutprobe spezifische Antikörperkomplexe hinzu, die gegen Blutzellen mit Ausnahme von Neutrophilen gerichtet sind.

Fügen Sie magnetische Partikel hinzu, die an die an den Antikörperkomplex gebundenen Blutzellen binden.

Übertragen Sie die immunomagnetisch markierte Probe in den Zellladeanschluss eines mikrofluidischen Chips.

Schließen Sie Magnetplatten an den Anschluss zum Laden der Zelle an.

Das Magnetfeld zieht die immunomagnetisch markierten Zellen an und fängt sie an den Seitenwänden des Ports ein.

Da die Neutrophilen nicht markiert sind, fließen sie in den Chip und werden im Andockbereich der Zelle gefangen.

Geben Sie die fluoreszenzmarkierte Chemolockstofflösung und das Migrationsmedium in die dafür vorgesehenen Reservoire. Die Flüssigkeiten strömen durch die mikrofluidischen Kanäle und bilden einen Konzentrationsgradienten.

Wenn der Chemolockstoff an den Neutrophilenrezeptor bindet, löst er intrazelluläre Veränderungen aus, die dazu führen, dass Neutrophile ihr Zytoskelett reorganisieren und Pseudopoden ausdehnen.

Diese Pseudopoden fungieren als Füße und treiben die Neutrophilen zu höheren Chemoattraktivstoffkonzentrationen – ein Prozess, der als Chemotaxis bezeichnet wird.

Verwenden Sie geeignete Mikroskopietechniken, um die Migration von Neutrophilen als Reaktion auf den Chemolockstoffgradienten zu überwachen.

Entfernen Sie das deionisierte Wasser aus dem Gerät und fügen Sie 100 Mikroliter Fibronektinlösung aus dem Auslass hinzu. Warten Sie drei Minuten, um sicherzustellen, dass alle Kanäle mit Fibronektinlösung gefüllt sind. Inkubieren Sie das Gerät dann eine Stunde lang in einer abgedeckten Petrischale bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie anschließend die Fibronektinlösung aus dem Gerät und fügen Sie 100 Mikroliter Migrationsmedium aus dem Auslass hinzu. Warten Sie erneut drei Minuten, um sicherzustellen, dass alle Kanäle mit dem Migrationsmedium gefüllt sind. Inkubieren Sie das Gerät für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur, bevor Sie das Gerät im Chemotaxis-Experiment verwenden. Geben Sie 10 Mikroliter Vollblut in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie dann 2 Mikroliter des Antikörpercocktails in zwei Mikroliter magnetischer Partikel aus einem Neutrophilen-Isolationskit hinzu und mischen Sie das Röhrchen vorsichtig, um die mit Antikörpern markierten Zellen magnetisch zu markieren. Die Etikettenmischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Befestigen Sie als Nächstes zwei kleine Magnetplatten an den beiden Seiten der Zellenladeöffnung des Geräts. Saugen Sie das Medium an allen Anschlüssen des Geräts an. Pipettieren Sie dann langsam zwei Mikroliter des markierten Blutgemisches aus der Zellladeöffnung in das mikrofluidische Gerät. Stellen Sie das mikrofluidische Gerät auf den temperaturgesteuerten Mikroskoptisch bei 37 Grad Celsius. Warten Sie einige Minuten, bis genügend Neutrophile im Andockbereich der Zellen gefangen sind.

Geben Sie als nächstes 100 Mikroliter der Chemolockstofflösung in 100 Mikroliter Migrationsmedium mit zwei Pipettieren in die dafür vorgesehenen Einlassreservoirs. Dadurch wird ein Chemoattraktivstoffgradient durch kontinuierliches laminares Mischen von Chemikalien erzeugt. Bei dem Chemoattraktor kann es sich um rekombinante Proteine wie FMLP oder klinische Proben handeln, wie z. B. der Überstand des Sputums von Patienten mit COPD.

Sobald sich die Strömung stabilisiert hat, nehmen Sie Fluoreszenzbilder des FITC-Dextrangradienten im Kanal auf. Inkubieren Sie das Gerät dann auf dem temperaturgesteuerten Mikroskoptisch oder in einem herkömmlichen Zellkultur-Inkubator für 15 Minuten. Nach der Inkubation bilden Sie den Gradientenkanal ab und verwenden Sie ein 10-fach-Objektiv, um die endgültigen Positionen der Zelle für die Datenanalyse aufzuzeichnen.