Ein in vitro Assay zur Untersuchung der Zytotoxizität von präaktivierten CD8⁺ T-Zellen gegen Krebszellen

Nehmen wir zwei CD8⁺ T-Zellpopulationen: Effektor-CD8⁺ T-Zellen, die durch Antikörper-vermittelte Interaktion von T-Zell- und co-stimulatorischen Rezeptoren voraktiviert wurden, und unterdrückte CD8⁺ T-Zellen, die durch myeloische Suppressorzellen gehemmt wurden.

Fügen Sie diese T-Zellen zu Basalmembran-beschichteten Vertiefungen mit Krebszellen hinzu, die ein nukleär-restriktives fluoreszierendes Protein exprimieren.

Pipettieren Sie ein fluorogenes Caspase-3-Substrat – einen DNA-bindenden fluorogenen Farbstoff, der an ein Caspase-3-Erkennungsstellen-haltiges Peptid konjugiert ist.

ausbrüten. Effektor-T-Zell-Rezeptoren binden an den MHC-Peptid-Komplex der Klasse I auf den Krebszellen und lösen die Freisetzung von zytotoxischen Granula aus, die Perforine und Granzyme enthalten.

Perforine bilden Membranporen von Krebszellen, die den Eintritt von Granzymen und die Caspase-Aktivierung ermöglichen und die Apoptose einleiten.

Aktivierte Caspasen spalten zusätzlich das fluorogene Caspase-Substrat und setzen den Farbstoff frei, der an die DNA bindet und fluoresziert.

Unter einem Fluoreszenzmikroskop zeigen Krebszellen, die mit Effektor-T-Zellen kokultiviert wurden, eine duale Kernfluoreszenz, die auf die Apoptose der Krebszellen hinweist.

Im Gegensatz dazu zeigen Krebszellen, die mit unterdrückten T-Zellen kokultiviert wurden, nur eine nukleäre Proteinfluoreszenz, was auf nicht-apoptotische Zellen hindeutet.

Um eine voraktivierte CD8-positive T-Zell-Zielzell-Cokultur einzurichten, fügen Sie zunächst 30 Mikroliter einer 1 bis 100 verdünnten Wachstumsfaktor-reduzierten löslichen Basalmembranmatrix in die entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit flachem Boden hinzu, die für die Mikroskopie geeignet ist. Schütteln Sie die Platte, um die Matrix gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie die Platte für mindestens eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator. Während sich die Platte äquilibriert, bereiten Sie die Zielzellen vor. Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie es mit PBS und fügen Sie 1 Milliliter 0,05 % Trypsin-EDTA bei Raumtemperatur für 1 Minute hinzu.

Fügen Sie 9 Milliliter DMEM hinzu, die durch vorsichtiges Pipettieren mit fötalem Rinderserum ergänzt werden, und überführen Sie die dissoziierten Zellen in Röhrchen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen wird das Pellet in 500 Mikrolitern EDMEM resuspendiert. Filtrieren Sie die resuspendierten Zellen durch ein Zellsieb und zählen Sie die lebenden Zellen. Stellen Sie dann die Dichte auf 4 mal 10 für die vierte Zielzelle pro Milliliter in frischem EDMEM auf Eis ein.

Pipettieren Sie anschließend die voraktivierten CD8-positiven T-Zellen einige Male, um die Zellen in eine Einzelzellsuspension zu resuspendieren, und übertragen Sie die schwimmenden T-Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Bedingung. Sammeln Sie alle verbleibenden Zellen mit 200 Mikrolitern PBS pro Well, geben Sie die Waschungen in die entsprechenden 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie. Saugen Sie das Medium an und geben Sie 1 Milliliter EDMEM in jedes Röhrchen für die Zentrifugation.

Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern frischem EDMEM pro Röhrchen. Nach der Zählung stellen Sie die Zellen in jedem Röhrchen auf eine Dichte von 1,6 mal 10 auf die fünften voraktivierten CD8-positiven T-Zellen pro Milliliter Medium ein und legen Sie die Zellen auf Eis. Wenn die Zellen fertig sind, aspirieren Sie die Basalmembranmatrix aus jeder Vertiefung der 96-Well-Mikroskopieplatte und fügen Sie 50 Mikroliter Zielzellen in einzelne Vertiefungen innerhalb der inneren 60 Vertiefungen der Platte durch Mischen hinzu.

Geben Sie 25 Mikroliter EDMEM, ergänzt mit 4 mal 10 bis zur dritten Einheit pro Milliliter IL-2, und 10 mikromolares fluorogenes Caspase-3-Substrat in die entsprechenden Vertiefungen. Geben Sie dann 25 Mikroliter voraktivierter CD8-positiver T-Zellen in die entsprechenden Vertiefungen und fügen Sie schließlich EDMEM in die entsprechenden Vertiefungen hinzu, um ein Gesamtvolumen von bis zu 100 Mikrolitern zu erhalten. Geben Sie 200 Mikroliter PBS oder steriles Wasser in alle leeren Vertiefungen, schütteln Sie die Platte und lassen Sie die Platte 10 Minuten lang auf einer ebenen Fläche stehen.

Um die Zellen abzubilden, stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es Bilder im Phasenkontrast sowie Fluoreszenzkanäle aufnimmt, die für das nuklearbeschränkte fluoreszierende Protein geeignet sind, und die fluorogenen aktivierten Caspase-3-Substrat-Fluorophore, die im Experiment verwendet wurden. Nehmen Sie dann Bilder jeder experimentellen Vertiefung im Phasenkontrast und der beiden Fluoreszenzkanäle alle ein bis drei Stunden für mindestens 72 Stunden auf.