Ein in vitro Assay zur Untersuchung der Zytotoxizität von präaktivierten CD8⁺ T-Zellen gegen Krebszellen

Nehmen wir zwei CD8⁺ T-Zellpopulationen: Effektor-CD8⁺ T-Zellen, die durch Antikörper-vermittelte Interaktion von T-Zell- und co-stimulatorischen Rezeptoren voraktiviert wurden, und unterdrückte CD8⁺ T-Zellen, die durch myeloische Suppressorzellen gehemmt wurden.

Fügen Sie diese T-Zellen zu Basalmembran-beschichteten Vertiefungen mit Krebszellen hinzu, die ein nukleär-restriktives fluoreszierendes Protein exprimieren.

Pipettieren Sie ein fluorogenes Caspase-3-Substrat – einen DNA-bindenden fluorogenen Farbstoff, der an ein Caspase-3-Erkennungsstellen-haltiges Peptid konjugiert ist.

ausbrüten. Effektor-T-Zell-Rezeptoren binden an den MHC-Peptid-Komplex der Klasse I auf den Krebszellen und lösen die Freisetzung von zytotoxischen Granula aus, die Perforine und Granzyme enthalten.

Perforine bilden Membranporen von Krebszellen, die den Eintritt von Granzymen und die Caspase-Aktivierung ermöglichen und die Apoptose einleiten.

Aktivierte Caspasen spalten zusätzlich das fluorogene Caspase-Substrat und setzen den Farbstoff frei, der an die DNA bindet und fluoresziert.

Unter einem Fluoreszenzmikroskop zeigen Krebszellen, die mit Effektor-T-Zellen kokultiviert wurden, eine duale Kernfluoresze