Ein Multiplex-Bead-basierter Assay zur Analyse von Zytokinen in menschlichen Tränenproben

Geben Sie menschliche Tränenproben und einen Antikörper-Bead-Cocktail in eine gewaschene Assay-Platte.

Die Antikörper sind an farbcodierte magnetische Kügelchen gebunden, die mit unterschiedlichen Anteilen von Fluorophoren imprägniert sind, die unterschiedlichen spektralen Signaturen entsprechen, was den Nachweis mehrerer Zytokine erleichtert.

Die Tränenzytokine binden an ihre entsprechenden beadgebundenen Fängerantikörper.

einem magnetischen Plattenwascher die Antikörper-Bead-Komplexe absetzen. Entfernen Sie mit Puffer die ungebundenen Biomoleküle.

Fügen Sie biotinylierte Nachweisantikörper hinzu, die an die gebundenen Zytokine binden.

Pipettieren Sie das Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat, das an die biotinylierten Antikörper bindet.

Entfernen Sie mit der Plattenwaschmaschine den ungebundenen Inhalt der Vertiefung. Resuspendieren Sie die Zytokin-gebundenen Komplexe in der Scheidenflüssigkeit.

Während der Probenanalyse transportiert das fluidische System die Bead-Komplexe zur Optikbaugruppe.

Der erste Laser aktiviert die internen Bead-Farbstoffe, wobei das resultierende Signal spezifische Zytokine identifiziert.

Der zweite Laser aktiviert das an den Bead-Komplex gebundene Reportermolekül, dessen Signalintensität die Zytokinkonzentration darstellt und so die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Zytokine ermöglicht.

Um den beadbasierten Multiplex-Assay durchzuführen, bringen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie fünf bis 10 Sekunden lang. Wenn eluierte Tränenproben vor dem Assay bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden, tauen Sie die gefrorenen Tränenextrakte auf Eis auf und zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 1.000-mal g. Bereiten Sie ein Assay-Arbeitsblatt in vertikaler Konfiguration für die Arbeit mit den humanen Zytokinstandards QC-1, QC-2 und Proben vor.

Geben Sie 200 Mikroliter 1x Waschpuffer in jede Vertiefung der Platte und verschließen Sie sie mit einem Plattenversiegeler. Dann die Platte auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubieren. Dekantieren Sie anschließend den 1x Waschpuffer, indem Sie die Platte umdrehen und mehrmals auf saugfähige Handtücher klopfen, um die Restmenge des Waschpuffers in den Vertiefungen zu entfernen.

Geben Sie dann 25 Mikroliter jedes funktionierenden humanen Zytokins Standard QC-1, QC-2 und den Blindwert nur mit Assay-Puffer und Proben in die entsprechenden Vertiefungen. Geben Sie 25 Mikroliter Assay-Puffer in jede Vertiefung. Geben Sie dann 25 Mikroliter 1x Antikörperbead-Cocktaillösung in die Vertiefungen.

Da die Antikörperbead-Lösung lichtempfindlich ist, versiegeln Sie die Platte und decken Sie sie mit Aluminiumfolie und Plattenabdeckung ab, um sie während des Assays vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie die Platte bei vier Grad Celsius auf einem Shaker über Nacht. Legen Sie die Platte am nächsten Tag auf das Plattengestell einer automatischen magnetischen Plattenwaschmaschine und lassen Sie sie eine Minute lang ruhen, um die magnetischen Kügelchen am Boden der Vertiefung abzusetzen.

Aspirieren Sie den Well-Inhalt und fügen Sie 200 Mikroliter Waschpuffer pro Well mit einer automatischen Magnetplattenwaschmaschine hinzu. Lassen Sie die Platte eine Minute lang stehen, saugen Sie dann den Inhalt der Vertiefung wie zuvor ab und wiederholen Sie den Waschgang noch einmal. Geben Sie 25 Mikroliter Nachweisantikörperlösung in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Platte, decken Sie sie mit Alufolie und Tellerabdeckung ab und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur auf einem Schüttler für 60 Minuten. Geben Sie dann 25 Mikroliter Streptavidin-Phycoerythrin-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte nach dem Versiegeln und Abdecken der Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.

Legen Sie die Platte nach der Inkubation auf eine magnetische Plattenscheibe und lassen Sie sie eine Minute lang ruhen. Saugen Sie dann den Inhalt der Vertiefung an und fügen Sie 200 Mikroliter Waschpuffer pro Vertiefung hinzu. Lassen Sie es eine Minute lang einwirken und saugen Sie dann den Inhalt der Vertiefung ab, bevor Sie den Waschvorgang erneut wiederholen. Geben Sie 150 Mikroliter Mantelflüssigkeit in jede Vertiefung. Legen Sie die Platte dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Shaker, um die Antikörperkügelchen zu resuspendieren, bevor Sie mit dem Ablesen der Platte und der Analyse der Zytokinkonzentrationen fortfahren.