Ein Mikroneutralisationsassay zur Messung neutralisierender Antikörpertiter im Humanserum

Für einen Mikroneutralisationsassay nehmen Sie eine Multiwell-Platte mit hitzeinaktiviertem, seriell verdünntem Humanserum mit abnehmenden Konzentrationen von Influenza-spezifischen neutralisierenden Antikörpern.

Führen Sie pathogene Influenzaviren ein. Serum-Antikörper interagieren mit den Viren und neutralisieren sie; Höhere Serumverdünnungen weisen jedoch eine begrenzte Virusneutralisation auf.

Seed mit Madine-Darby-Canin-Nierenzellen oder MDCK-Zellen, die menschliche Sialinsäurereste auf ihrer Oberfläche überexprimieren.

In der höheren Verdünnung verschmelzen nicht-neutralisierte Influenzaviren mit der Sialinsäure der Zellen und geben das virale Genom in das Zellzytoplasma ab.

Die viralen Gene werden transkribiert und in der Wirtszelle in virale Proteine und Nukleoproteine übersetzt.

Mit einer hohen Konzentration an Aceton zur Fixierung und Permeabilisierung behandeln.

Einführung von Primärantikörpern, die mit viralen Nukleoproteinen interagieren.

Overlay mit enzymkonjugierten Sekundärantikörpern, die mit Primärantikörpern interagieren. Waschen und behandeln Sie mit dem Substrat des Enzyms, um ein Farbprodukt herzustellen.

Quantifizieren Sie die Farbintensitäten und vergleichen Sie sie mit der Serumverdünnung; die höchste Serumverdünnung, die eine fünfzigprozentige Virusneutralisation erreicht, stellt den Neutralisationstiter dar.

Tauen Sie die Seren an Tag 1 des MN-Assays in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf und entfernen Sie sie sofort nach dem Auftauen. Inaktivieren Sie die menschlichen Seren für 30 Minuten in einem 56 Grad Celsius warmen Wasserbad, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie dann die Seren auf Eis und fügen Sie das Virusverdünnungsmittel zu den Seren hinzu, um eine Vorverdünnung von 1 bis 10 zu erreichen.

Um mit einem Virus zu testen, fügen Sie 50 Mikroliter Virusverdünnungsmittel in die Zeilen B bis H hinzu, mit Ausnahme der Spalten 11 und 12. Geben Sie dann 100 Mikroliter 1 von 10 verdünnten Seren in die Spalten A1 bis A10. Eine zweifache serielle Verdünnung von den Reihen A bis H wird durchgeführt und die letzten 50 Mikroliter in Reihe H verworfen.

Für die Viruskontrolle geben Sie 50 Mikroliter Virusverdünnungsmittel in die Vertiefungen A12, B12, C12 und D12. Für die Zellkontrolle geben Sie 100 Mikroliter Virusverdünnungsmittel in die Vertiefungen E12, F12, G12 und H12. Für die Kontrollseren werden 100 Mikroliter verdünnte Kontrollseren in Vertiefung A, Spalte 11, und 50 Mikroliter Virusverdünnungsmittel in die Vertiefungen B11 bis H11 gegeben. Fahren Sie mit der seriellen Verdünnung fort. Decken Sie die Platten ab und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, bis sie für die Viruszugabe bereit sind.

Für die Viruszugabe verdünnen Sie das Virus auf 100 TCID50 in 50 Mikrolitern mit Virusverdünnungsmittel. Geben Sie 50 Mikroliter verdünntes Virus in alle Vertiefungen, mit Ausnahme von Spalte 11 auf den hinteren Titrationsplatten und den Zellkontrollvertiefungen E12, F12, G12 und H12 auf allen Platten. 50 Mikroliter Virusverdünnungsmittel in alle Vertiefungen in Spalte 11 geben. Geben Sie dann 50 Mikroliter des Virus zu 100 TCID50 in 50 Mikroliter in die erste Vertiefung

.

Mischen Sie anschließend 50 Mikroliter und überführen Sie sie in aufeinanderfolgende Vertiefungen, um zweifache serielle Verdünnungen durchzuführen. Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Vertiefungen, um eine Virusverschleppung zu vermeiden. 50 Mikroliter aus der Vertiefung H11 verwerfen und dann 50 Mikroliter Virusverdünnungsmittel in Spalte 11 geben, um das endgültige Volumen auf 100 Mikroliter zu bringen. Tippen Sie zum Mischen auf die Teller. Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie am ersten Tag die MDCK-Zellzugabe und am zweiten Tag wie zuvor den ELISA durchführen.

Nach Zugabe der primären und sekundären Antikörper, wie im Textprotokoll beschrieben, führen Sie die Substratzugabe und das Lesen der Platte durch. Waschen Sie die Teller fünfmal mit 300 Mikrolitern Waschpuffer und klopfen Sie auf ein fusselfreies Tuch. Geben Sie 100 Mikroliter frisch vorbereitetes OPD-Substrat in jede Vertiefung. Dann inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur, bis die Vertiefungen der Viruskontrolle eine optische Dichte bei 490 Nanometern zwischen 0,8 und 3 erreichen, wobei die Zellkontrolle bei einem niedrigen Hintergrund-OD von weniger als 0,2 liegt. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der Stopplösung in alle Vertiefungen.

Lesen Sie den Außendurchmesser der Vertiefungen bei 490 Nanometern mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer ab. Bestimmen Sie abschließend den neutralisierenden Antikörpertiter jeder Serumprobe, wie im Textprotokoll beschrieben.