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Immunologie
0 Aufrufe • 3:03 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer Multiwell-Platte, die bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit der Maus enthält, die eine Immunzellpopulation umfasst, die mit einem grün fluoreszierenden Viabilitätsfarbstoff gefärbt ist.
Führen Sie Fc-Antikörper ein, um die Fc-Rezeptoren der Immunzellen zu blockieren.
Fügen Sie einen Cocktail aus unterschiedlichen Fluorophor-markierten Antikörpern hinzu, die auf bestimmte Zellmarker abzielen. Entfernen Sie ungebundene Antikörper und resuspendieren Sie die Zellen in einem Puffer.
Identifizieren Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie schwache Fluoreszenz-Singuletts, die auf lebende Zellen hinweisen.
Beleuchten Sie Zellen bei 488 Nanometern, wodurch Zellen rote Fluoreszenz emittieren, die mit CD11c-exprimierenden Zellen korreliert.
Innerhalb der Population mit hohem CD11c-Gehalt können mit geeigneten Wellenlängenfiltern die Zellmarkerproteine MHC-II auf dendritischen Zellen und SiglecF auf Makrophagen identifiziert werden.
In der CD11c-niedrigen Population ermöglicht die Expression von CD3 auf T-Zellen und CD19 auf B-Zellen deren Identifizierung.
Beleuchten Sie Zellen in einer Tiefe von 405 Nanometern, die eine blaue Fluoreszenz emittieren, die die CD11b-exprimierenden Neutrophilen anzeigt.
Die Beleuchtung von Zellen in einer Tiefe von 633 Nanometern regt dunkelrote Fluorophore auf Ly-6G-exprimierenden Eosinophilen an.
Anhand von Durchflusszytometriedaten wird die Häufigkeit jeder Art von Immunzelle in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit aufgezählt.
Nach der dritten bronchoalveolären Lavage-Entnahme zentrifugieren Sie das gepoolte Aspirat und lagern den Überstand bei minus 80 Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern ACK-Lysepuffer. Nach spätestens zwei Minuten bei Raumtemperatur verdünnen Sie den Lysepuffer mit einem Milliliter kaltem PBS und sammeln die Zellen durch Zentrifugation.
Resuspendieren Sie das Pellet in dem für die Anzahl der zu analysierenden Proben geeigneten PBS-Volumen und aliquotieren Sie die Zellen für die Analyse in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Sammeln Sie die Zellen durch eine weitere Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern FC-Block in PBS.
Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur geben Sie 50 Mikroliter des entsprechenden Antikörpercocktails in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius lichtgeschützt. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Platte und verwerfen den Überstand, wobei die Pellets für die durchflusszytometrische Analyse auf ein Endvolumen von 200 Mikrolitern FACS-Puffer pro Vertiefung resuspendiert werden.