Ein Aktivkohle-Agar-Resazurin-Assay zur Bewertung der Aktivität der Testsubstanz gegen Mykobakterien

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit Mykobakterien. Geben Sie steigende Konzentrationen von Testverbindungen in die Vertiefungen.

ausbrüten. Abhängig von der Wirkung der Verbindung auf Mykobakterien kann sie entweder das Wachstum von Mykobakterien hemmen und eine bakteriostatische Aktivität aufweisen, oder Mykobakterien eliminieren, die eine bakterizide Aktivität zeigen.

Übertragen Sie die Well-Aliquots in einen Aktivkohle-Agar-Resazurin-Assay (CARA), eine Mikrotiterplatte, die Agar mit Aktivkohle enthält, um die Testverbindung zu absorbieren und Verschleppungseffekte zu vermeiden.

ausbrüten. Die bakteriostatische Aktivität der Verbindung hemmt die mykobakterielle Replikation, während die bakterizide Aktivität die Lebensfähigkeit der Mykobakterien verringert.

Fügen Sie Puffer, Resazurin und ein nichtionisches Tensid hinzu, um Resazurin in den Vertiefungen zu dispergieren.

Bei den stoffwechselaktiven Mykobakterien reduzieren die Dehydrogenasen das bläulich gefärbte, schwach fluoreszierende Resazurin zu einem rosafarbenen, fluoreszierenden Resorufin.

Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Resorufin-Fluoreszenz in den Wells.

Vertiefungen ohne Resorufin-Fluoreszenz weisen auf die bakterizide Aktivität der Verbindung hin.

Eine unterschiedliche Fluoreszenzintensität über die Vertiefungen hinweg zeigt die Belastung mit lebenden Bakterien an und spiegelt die konzentrationsabhängige bakterizide oder bakteriostatische Potenz der Testverbindungen wider.

Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen mit rundem oder konischem Boden, die 4 bzw. 20 Milliliter Middlebrook 7H9-ADN oder 7H9-OADC enthalten, werden mit M. smegmatis bei einem OD₅₈₀ von 0,01 bis 0,1 inokuliert. Inkubieren Sie die M. smegmatis-Kulturen bei 37 Grad Celsius und 20 %_O2 unter Schütteln, wobei die Kulturen bis zur mittleren logarithmischen Phase oder einem ungefähren OD₅₈₀ von 0,5 erweitert werden.

Um ein Experiment mit minimaler inhibitorischer Konzentration unter replizierenden und nicht-replizierenden Bedingungen durchzuführen, verteilen Sie 200 Mikroliter Zellen in 7H9-ADN bei einem OD₅₈₀ von 0,01 in alle Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit klarem Boden, die mit Gewebekulturen behandelt wurde.

Verwenden Sie für den nicht-replizierenden Assay PBS mit 0,02 % Tyloxapol, um die Zellen zweimal zu waschen, und verwenden Sie ein nicht replizierendes Medium, um die Zellen zu resuspendieren. Verwenden Sie ein nicht replizierendes Medium, um die Zellen auf einen OD₅₈₀ von 0,1 zu verdünnen, und fügen Sie Natriumnitrit bis zu einer Endkonzentration von 0,5 bis 5 Millimolar aus einem frisch zubereiteten 1-Molar-Stamm hinzu.

Verteilen Sie 200 Mikroliter Zellen mit einem OD₅₈₀ von 0,1 in alle Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit klarem Boden, die mit Gewebekulturen behandelt wurde. Nach der Vorbereitung der Testmittel gemäß dem Textprotokoll werden 2 Mikroliter des Testmittels #1 in die Reihen A bis E und 2 Mikroliter des Testmittels #2 in die Reihen E bis H gegeben und gründlich gemischt.

Für die Replikation von Assays inkubieren Sie M. smegmatis-Mikrotiterplatten bei 37 Grad Celsius, 20 %_{O 2} und 5 % CO₂ für 1 bis 48 Stunden. Verwenden Sie zu den Zeitpunkten, zu denen das CARA als Ausleseeinheit verwendet wird, eine P200-Mehrkanalpipette mit einem Fassungsvermögen von 50 bis 75 Mikrolitern, um den Well-Inhalt der MIC90-Assay-Platte vorsichtig zu resuspendieren, indem Sie 5 bis 10 Mal auf und ab pipettieren. Schwenken Sie dann mit den Pipettenspitzen den Inhalt der Vertiefungen vorsichtig in kreisenden Bewegungen.

Übertragen Sie 10 Mikroliter des unverdünnten Assay-Well-Inhalts in die entsprechenden Wells der CARA-Mikroplatte, vermeiden Sie Spritzer während des Transfers und stellen Sie sicher, dass das 10-Mikroliter-Aliquot in der Mitte der CARA-Mikrotiterplatten-Wells aufgedeckt wird. Binden Sie die Stapel der CARA-Mikrotiterplatten mit Klebeband zusammen und legen Sie sie dann in eine wiederverschließbare Plastiktüte. Inkubieren Sie die M. smegmatis CARA-Mikroplatten bei 37 Grad Celsius mit 20 % O₂ für ein bis zwei Tage für replizierende Platten und zwei bis drei Tage für nicht replizierende Platten.

Wenn ein Film von Bakterienwachstum oder größere makroskopische Kolonien in den Negativkontrollvertiefungen sichtbar sind, verwenden Sie einen einzigen Satz von 12 P200-Spitzen mit einer Mehrkanalpipette, um 40 Mikroliter steriles PBS entlang der Seite der Vertiefungen abzugeben, und lassen Sie das PBS über die Oberseite der bakteriellen Agar-Mikrokolonien verteilen.

Bereiten Sie das CARA-Entwicklungsreagenz vor, indem Sie 5 Milligramm Resazurin und 50 Milliliter 5% Tween-80 in PBS mischen. Geben Sie 50 Mikroliter frisch zubereitetes CARA-Entwicklungsreagenz in jede Vertiefung der CARA-Mikroplatte. Schütteln Sie dann die Platten ein paar Mal hin und her, um das Reagenz auf dem Agar und der Bakterienmatte in jeder Vertiefung zu verteilen. Legen Sie die Platten in einen wiederverschließbaren Plastikbeutel und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius für M. smegmatis.

Legen Sie die CARA-Mikrotiterplatten vor der Fluoreszenzmessung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in eine Biosicherheitshaube, wobei die Deckel entfernt wurden. Wenn Sie BSL3-Spektralphotometer außerhalb einer Biosicherheitswerkbank verwenden, kleben Sie einen PCR-Aufkleber in optischer Qualität auf die Platte und verwenden Sie ein weiches Papiertuch, um sie fest zu verschließen, indem Sie leicht auf die Aufkleberoberfläche drücken. Bestimmen Sie die Fluoreszenz per Top-Read mit Anregung bei 530 Nanometern und Emission bei 590 Nanometern.