JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 4:08 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie Röhrchen mit Reportermakrophagen mit dem Gen für die sezernierte embryonale alkalische Phosphatase oder das SEAP-Enzym unter einem induzierbaren Promotor.
Führen Sie in einem Röhrchen einen Antikörper ein, der spezifisch für den Makrophagen-Toll-like-Rezeptor 2 oder TLR2 ist und dessen Aktivität neutralisiert.
In einem anderen Fall fügen Sie einen Inhibitor hinzu, um die TLR4-Signalübertragung zu unterdrücken. Lassen Sie die letzte Tube unbehandelt.
Nehmen Sie einen kammerförmigen Objektträger mit einer adsorbierten Schicht aus schadensassoziierten molekularen Mustern oder DAMPs – Proteinen, die während der Zellnekrose freigesetzt werden.
Behandelte und unbehandelte Makrophagen in getrennte Vertiefungen geben und inkubieren.
TLR2 und TLR4 binden auf unbehandelten Makrophagen an DAMPs und aktivieren die Transkriptionsfaktoren Kernfaktor-kappa-B oder NF-κB und Aktivatorprotein-1 oder AP-1.
Diese translozieren in den Zellkern und binden an den SEAP-Promotor, wodurch die SEAP-Produktion hochreguliert wird, die extrazellulär sezerniert wird.
Übertragen Sie den SEAP-haltigen Überstand auf eine Mikroplatte mit einem chromogenen Substrat.
SEAP hydrolysiert das Substrat und erzeu
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