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Immunologie
0 Aufrufe • 4:08 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie Röhrchen mit Reportermakrophagen mit dem Gen für die sezernierte embryonale alkalische Phosphatase oder das SEAP-Enzym unter einem induzierbaren Promotor.
Führen Sie in einem Röhrchen einen Antikörper ein, der spezifisch für den Makrophagen-Toll-like-Rezeptor 2 oder TLR2 ist und dessen Aktivität neutralisiert.
In einem anderen Fall fügen Sie einen Inhibitor hinzu, um die TLR4-Signalübertragung zu unterdrücken. Lassen Sie die letzte Tube unbehandelt.
Nehmen Sie einen kammerförmigen Objektträger mit einer adsorbierten Schicht aus schadensassoziierten molekularen Mustern oder DAMPs – Proteinen, die während der Zellnekrose freigesetzt werden.
Behandelte und unbehandelte Makrophagen in getrennte Vertiefungen geben und inkubieren.
TLR2 und TLR4 binden auf unbehandelten Makrophagen an DAMPs und aktivieren die Transkriptionsfaktoren Kernfaktor-kappa-B oder NF-κB und Aktivatorprotein-1 oder AP-1.
Diese translozieren in den Zellkern und binden an den SEAP-Promotor, wodurch die SEAP-Produktion hochreguliert wird, die extrazellulär sezerniert wird.
Übertragen Sie den SEAP-haltigen Überstand auf eine Mikroplatte mit einem chromogenen Substrat.
SEAP hydrolysiert das Substrat und erzeugt ein violett-blaues Produkt. Messen Sie die Absorption.
Die TLR2-Neutralisation reduziert die SEAP-Produktion stark, was auf TLR2 als primären Mediator hinweist.
Um die Auswirkungen einer adsorbierten Proteinschicht auf die Toll-like-Rezeptor-vermittelte NF-kB/AP-1-Aktivität zu bewerten, werden die Zellen nach dem Züchten von Reportermakrophagen in einem Kolben geeigneter Größe auf 70 % Konfluenz abgelöst, wie gezeigt, mit einer geeigneten enzymatischen Dissoziationslösung.
Resuspendieren Sie die Zellen bei einer Konzentration von 7,3 x 105 Zellen pro Milliliter im Assay-Medium und aliquotieren Sie die Zellen gleichmäßig auf drei Röhrchen. Behandeln Sie das erste Zellröhrchen 60 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Mikrogramm pro Milliliter TLR4-Hemmer. Behandeln Sie das zweite Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Anti-TLR2-Antikörper und lassen Sie das dritte Röhrchen ohne Behandlung bei Raumtemperatur.
Während die Zellen inkubieren, fügen Sie 200 Mikroliter Lysat und 10 % fötales Rinderserum in drei klebrige Vertiefungen pro Bedingung hinzu. Lassen Sie die Proteine für den entsprechenden Versuchszeitraum bei 37 Grad Celsius adsorbieren, bevor Sie die Proteinlösungen mit einer neuen Pasteurpipette für jede Vertiefung aspirieren und die Oberflächen der klebrigen Vertiefung dreimal mit 250 Mikrolitern PBS pro Vertiefung für 5 Minuten pro Wäsche waschen.
Geben Sie am Ende der Reporter-Makrophagen-Behandlung 200 Mikroliter Zelllösung in jede Vertiefung. Geben Sie Pam3CSK4 in einer Endkonzentration von 150 Nanogramm pro Milliliter in zwei Vertiefungen als TLR2-positive Kontrolle, wie im Schema dargestellt.
Für eine TLR4-Positivkontrolle geben Sie Lipopolysaccharid in einer Endkonzentration von 1,5 Mikrogramm pro Milliliter in zwei Vertiefungen. Nach 20 Stunden bei 37 Grad Celsius werden 20 Mikroliter Überstand aus jeder Vertiefung in doppelter Ausführung in eine 96-Well-Platte abgefüllt, einschließlich drei Vertiefungen mit 20 Mikrolitern Assay-Medium pro Vertiefung sowie die Hintergrundkontrolle.
Geben Sie anschließend 200 Mikroliter SEAP-Reporter-Assay-Reagenz in jede Vertiefung und decken Sie die Platte mit einem Klebesiegel ab, um eine zweieinhalbstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius zu gewährleisten. Den Rest des Überstands in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pro klebriger Vertiefung umfüllen und den Schmutz durch Zentrifugation sedimentieren. Anschließend werden die Überstände in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen für eine Lagerung bei minus 80 Grad Celsius für die nachgeschaltete proinflammatorische Zytokinanalyse mittels ELISA überführt. Entfernen Sie am Ende der Inkubation das Klebesiegel von der Platte und lesen Sie die Absorption auf einem Plattenleser bei 635 Nanometern ab.