Ein Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von CAR-T-Zellen

Beginnen Sie mit einer E-Platte mit Zellkulturmedium – einer Platte mit Goldmikroelektroden im Boden jeder Vertiefung.

Besiedeln Sie die Platte mit Zielkrebszellen, die an den Goldmikroelektroden haften und eine physikalische Barriere zwischen den Elektroden bilden.

Übertragen Sie die Platte auf einen Zellanalysator und legen Sie ein elektrisches Signal an.

Anhaftende Zellen stören den Elektronenfluss zwischen den Elektroden, was zu einem behinderten Elektronenfluss führt, gemessen als Impedanz.

Wenn sich diese Zellen vermehren und an den Elektroden haften, steigt die elektrische Impedanz proportional mit der Anzahl der adhärenten Zellen an, was eine Echtzeitmessung ermöglicht.

Einführung chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen oder CAR-T-Zellen, die chimäre Antigenrezeptoren exprimieren. Diese Rezeptoren interagieren mit den Antigenen von Krebszellen, aktivieren T-Zellen und bilden eine immunologische Synapse.

Aktivierte CAR-T-Zellen setzen zytotoxische Substanzen frei, darunter Perforine und Granzyme.

Perforine bilden Poren in der Krebszellmembran, wodurch Granzyme in die Zellen eindringen und die Zytolyse induzieren können.

Dies fördert die Zellablösung, verringert die elektrische Impedanz und korreliert mit dem Zytolysepotenzial der CAR-T-Zellen.

Für einen Echtzeit-Zytolyse-Wirksamkeitsassay geben Sie 50 bis 100 Mikroliter Zielzellkulturmedium in jede Vertiefung einer E-Platte und messen Sie die Hintergrundimpedanz im Zellanalysegerät.

Lösen Sie die Zielkrebszellen mit Trypsin von der Kulturplatte. Waschen Sie die Zellen in 15 Millilitern frischem Nährmedium und zentrifugieren Sie. Suspendieren Sie das Krebszellpellet zum Zählen in 5 Millilitern frischem Medium und stellen Sie die Zelldichte auf die entsprechende Zielzellkonzentration ein. Geben Sie die Zellen in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen und lassen Sie die E-Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich die Zellen gleichmäßig auf dem Boden der Vertiefungen absetzen können.

Legen Sie die Platte am Ende der Gleichgewichtsperiode in den Echtzeit-Zellanalysator und starten Sie die Messung der Impedanz automatisch alle 15 Minuten über Nacht. Die Adhäsion und Proliferation der Zielzellen kann in Echtzeit verfolgt werden.

Am nächsten Morgen verdünnen Sie das Effektor-CAR und die Kontroll-T-Zellen auf die entsprechende Konzentration in einzelnen Röhrchen und entnehmen Sie 50 bis 100 Mikroliter aus jeder Vertiefung der E-Platte, so dass das endgültige Volumen in jeder Vertiefung 100 Mikroliter beträgt. Sehen Sie sich als Nächstes den Effektor und die Kontroll-T-Zellen in den entsprechenden Vertiefungen mit den entsprechenden Effektor-zu-Ziel-Verhältnissen in 100 Mikrolitern Medium pro Vertiefung an. Anschließend wird die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert, bevor die Platte wieder in das Zellanalysatorsystem eingesetzt wird.

Um die Wirksamkeit der T-Zell-vermittelten Abtötung der Zielkrebszellen zu messen, überwachen Sie die CAR-T-Zell-vermittelte Abtötung für 96 Stunden.