JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 5:54 Min. • July 8th, 2025
Man nehme eine Multiwell-Platte mit Maus-Fibroblasten in Medien ohne Serumentzug und füge serielle Verdünnungen von TNFα-spezifischen Antikörpern hinzu.
Fügen Sie TNFα hinzu – ein entzündliches Zytokin.
ausbrüten. Serumentzug induziert zellulären Stress, der die Zellen anfällig für TNFα-vermittelte Apoptose macht.
Die Bindung von TNFα an seine Rezeptoren auf den serumarmen Zellen löst intrazelluläre Signalkaskaden aus, die Caspase-Kaskade aktivieren und Apoptose induzieren.
Die Bindung von Antikörpern an TNFα verhindert jedoch die Rezeptorbindung und hemmt die Caspase-Aktivierung.
Nach der Inkubation fügen Sie eine Reagenzmischung hinzu, die Detergens, ein prolumineszierendes Caspase-Substrat und ein Luciferase-Enzym zusammen mit ATP- und Magnesiumionen enthält. Mischen und inkubieren.
Das Detergens permeabilisiert die Membranen und setzt Caspasen aus TNFα-induzierten Zellen frei.
Das biolumineszierende Substrat enthält eine Caspase-Erkennungsstelle. Spezifische Caspasen spalten das Substrat und erzeugen Aminoluciferin.
Luciferase oxidiert ihr Substrat Aminoluciferin, was zu einer Lichtemission führt.
Messen Sie die Lumineszenzintensität, um einen Rückgang der Lumineszenz mit zunehmenden Antikörperkonzentrationen zu erkennen, was auf die Wirksamkeit der TNFα-spezifischen Antikörper zur Neutralisierung von TNFα und zur Verhinderung der TNFα-induzierten Apoptose hinweist.
Geben Sie 50 Mikroliter Zellsuspension in die internen 60 Vertiefungen der Assay-Platte, beginnend mit Spalte 2 bis 11. Mischen Sie die Zellsuspension durch Pipettieren, um der Mikroplatte Aliquote hinzuzufügen. Übertragen Sie sofort 50 Mikroliter der kartierten Verdünnungen auf die Assay-Platte.
Für parallele Bahnen dosieren Sie Verdünnungen, indem Sie die Mikropipette umdrehen. Die kartierten Verdünnungen können in der folgenden Reihenfolge in die Vertiefungen dosiert werden. Die Kontrollen werden in den umliegenden Brunnen abgegeben.
Verdünnen Sie TNF-alpha mit 500 Mikrolitern Reinstwasser. Mischen Sie mit einem Vortex-Mischer bei 2.200 U/min. Geben Sie es in ein 15-ml-Röhrchen und verdünnen Sie es schließlich auf 40 Nanogramm pro ml mit Assay-Kulturmedium. Geben Sie 50 Mikroliter der Apoptose-Induktionslösung in die 60 internen Außenvertiefungen. Geben Sie Mikroliter der Apoptose-Induktionslösung in die 60 internen Assay-Wells. Zum Schluss 16 Stunden lang inkubieren.
Am fünften Tag rekonstituieren Sie das Substrat mit seiner Pufferlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Mischen, indem fünfmal umgedreht wird. Geben Sie die Substratlösung ab und geben Sie 50 Mikroliter der Substratlösung in jede Probenvertiefung in der Assay-Platte. Fügen Sie außerdem Substrat zu den Steuerelementen hinzu. Rühren Sie den Assay drei Minuten lang in einem Vortexmischer bei 400 U/min.
Nehmen Sie die Assay-Platte aus dem Mischer und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur. Schalten Sie ein Spektralphotometer mit Plattenleser ein. Öffnen Sie die Softmax Pro-Software oder ein gleichwertiges Programm. Legen Sie die Mikroplatte in das Spektralphotometer und stellen Sie die folgenden Parameter ein.
Aktivieren Sie die Lumineszenzfunktion auf dem Rig, geben Sie die Funktion "Endpunkt" ein. Passen Sie den Rig-Bereich mit Ausnahme der Spalten 1 und 12 an. Wählen Sie als Plattentyp eine 96-Well-Standard-Mikroplatte mit klarem Boden. Ändern Sie die Integrationszeit auf bis zu 1250 Millisekunden. Stellen Sie die Schüttelzeit für die Mikroplatte auf 10 Sekunden ein. Wählen Sie die Wand aus, in der die Referenzsubstanz, die analytische Substanz und die Kontrollprobe platziert werden sollen. Beginne zu lesen.