JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 5:54 Min. • July 8th, 2025
Man nehme eine Multiwell-Platte mit Maus-Fibroblasten in Medien ohne Serumentzug und füge serielle Verdünnungen von TNFα-spezifischen Antikörpern hinzu.
Fügen Sie TNFα hinzu – ein entzündliches Zytokin.
ausbrüten. Serumentzug induziert zellulären Stress, der die Zellen anfällig für TNFα-vermittelte Apoptose macht.
Die Bindung von TNFα an seine Rezeptoren auf den serumarmen Zellen löst intrazelluläre Signalkaskaden aus, die Caspase-Kaskade aktivieren und Apoptose induzieren.
Die Bindung von Antikörpern an TNFα verhindert jedoch die Rezeptorbindung und hemmt die Caspase-Aktivierung.
Nach der Inkubation fügen Sie eine Reagenzmischung hinzu, die Detergens, ein prolumineszierendes Caspase-Substrat und ein Luciferase-Enzym zusammen mit ATP- und Magnesiumionen enthält. Mischen und inkubieren.
Das Detergens permeabilisiert die Membranen und setzt Caspasen aus TNFα-induzierten Zellen frei.
Das biolumineszierende Substrat enthält eine Caspase-Erkennungsstelle. Spezifische Caspasen spalten das Substrat und erzeugen Aminoluciferin.
Luciferase oxidiert ihr Substrat Aminoluciferin, was zu einer Lichtemission führt.
Messen Sie die Lumineszenzintensität, um einen Rückgang der Lumineszenz mit zuneh
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos