Lokalisierte Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie zum Nachweis von Proteinsekreten aus einer einzelnen Zelle

Beginnen Sie mit einem Glassensorchip mit funktionalisierten nanostrukturierten Gold-Arrays mit einer selbstorganisierten Monoschicht, die Carboxylgruppen enthält.

Befestigen Sie den Chip in einer mikrofluidischen Anordnung und führen Sie einen Linker ein, um die Carboxylgruppen zu aktivieren.

Fügen Sie Peptidliganden hinzu, die über Linker mit den aktivierten Carboxylgruppen konjugieren.

Mit einem Deaktivator-Compound-haltigen Puffer behandeln, unspezifische Bindungsstellen deaktivieren und mit einem Puffer waschen.

Fokussieren Sie ein polarisiertes Licht auf den Chip. Mit einem lokalisierten Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie-System erhalten Sie ein Bild der Arrays, das als helle Quadrate vor einem dunklen Hintergrund erscheint.

Beim Resonanzwinkel absorbieren die Goldelektronen das Licht. Messen Sie die Intensität des reflektierten Lichts im entsprechenden Winkel, um die Sensorreaktion zu erzeugen.

Führen Sie proteinsezernierende Hybridomzellen ein, die an den Chip binden und waschen.

Die angehängten Zellen sezernieren Proteine, die mit den Liganden auf dem nahe gelegenen Array interagieren.

Diese Wechselwirkungen verändern den Winkel und die Intensität des reflektierten Lichts, was zu einer Änderung der Sensorreaktion führt, was die sekretorische Aktivität der Zellen bestätigt.

Zur Reinigung und Regeneration der lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR-Chips) wird Plasmaasche mit einer Leistung von 40 Watt in einem 300-Milliliter-Gemisch aus 5 % Wasserstoff und 95 % Argon für 45 Sekunden aufgeblasen. Funktionalisieren Sie die Goldoberfläche und die Nanostrukturen unmittelbar nach der Plasma-Veraschung, indem Sie den Chip in eine Zweikomponenten-ethanolische Thiollösung eintauchen, die aus einem 3:1-Verhältnis von SPO und SPC besteht. Nachdem Sie den Chip über Nacht in der Thiollösung belassen haben, um eine selbstorganisierte Monoschicht zu bilden, spülen Sie ihn mit Ethanol ab und trocknen Sie ihn mit Stickstoffgas.

Laden Sie den LSPR-Chip in einen speziell angefertigten mikrofluidischen Halter, indem Sie den Chip auf ein Aluminium-Unterteil legen. Stecken Sie dann den Chip zwischen dieses untere Stück und eine Silikondichtung und ein durchsichtiges Kunststoffoberteil, indem Sie vier Schrauben verwenden, um die Baugruppe zu klemmen.

Für eine typische SPC-basierte Thiolanwendung werden 300 Mikroliter einer 1:1-Mischung aus 133 Millimolar EDC und 33 Millimolar NHS in deionisiertem destilliertem Wasser tropfenbeschichtet, um die Carboxylgruppen der SPC-Thiolkomponente zu aktivieren. Nachdem Sie 10 Minuten gewartet haben, spülen Sie die Oberfläche manuell mit 10 Millimolar PBS ab.

Anschließend konjugieren Sie die aktivierte Carboxylgruppe mit dem interessierenden Liganden, indem Sie 300 Mikroliter der Ligandenlösung tropfenbeschichten. Nachdem Sie 1 Stunde gewartet und die Oberfläche mit 10 Millimolar PBS gespült haben, werden 300 Mikroliter 0,1 molare Ethanolamin in PBS auf den Chip tropfen gelassen, um unspezifische Bindungen zu minimieren. Nachdem Sie 10 Minuten gewartet haben, waschen Sie das Ethanolamin mit PBS, das 0,005 % Tween 20 oder PBS-T20 enthält.

Platzieren Sie als Nächstes ein Quarzstück über dem Chip, um Schwankungen in den Daten im Zusammenhang mit einem sich verändernden Meniskus zu reduzieren. Halten Sie den Chip mit PBS-T20-Puffer feucht, während Sie ihn auf das Mikroskop montieren. Befestigen Sie den Mikrofluidikschlauch an der Baugruppe und dem Durchflusspuffer, bis ein stationärer Zustand erreicht ist. Setzen Sie dann die LSPR-Spitzenbaugruppe fest in den beheizten Probenhalter ein.

Der optische Aufbau für diese Methode ist hier dargestellt. Das Licht der Halogenlampe wird durch einen 593 Nanometer langen Durchlassfilter geleitet, um Wellenlängen zu eliminieren, die nicht zur nanoplasmonischen Reaktion beitragen. Das Licht wird dann linear polarisiert und die Probe über ein Objektiv mit 40x 1,4 numerischer Apertur beleuchtet, um die plasmonischen Goldnanostrukturen anzuregen. Das Streulicht wird vom Objektiv gesammelt und durch einen gekreuzten Polarisator geleitet, um das Hintergrundsignal vom Glassubstrat zu reduzieren. Ein 50/50-Strahlteiler wird in den gesammelten Strahlengang eingeführt, um gleichzeitig spektroskopische und bildhafte Analysen durchzuführen.

Nachdem Sie die Baugruppe und das Mikroskop mindestens zwei Stunden lang äquilibriert haben, richten Sie den Chip mit dem Joystick so aus, dass das zentrale Array mit der Faseroptik für die Spektroskopie ausgerichtet ist. Nachdem Sie Hybridomzellen durch Zentrifugation kultiviert und pelletiert haben, ernten Sie sie. Testen Sie dann die Lebensfähigkeit, bevor Sie sie auf die LSPR-Chips aufbringen. Anschließend werden 50 Mikroliter der Zelllösung manuell mit einer Mikropipette auf die LSPR-Chips aufgebracht. Waschen Sie abschließend die verbleibenden Zellen in Lösung mit frischen serumfreien Medien unter Verwendung eines mikrofluidischen Perfusionssystems ab, um die LSPR-Chips für die Bildgebung vorzubereiten.