Quantifizierung der autophagischen Sequestrierungsaktivität in Säugetierzellen

Bei der Bulk-Autophagie werden autophagische Fracht und lösliche zytosolische Proteine, einschließlich Laktatdehydrogenase oder LDH, in Autophagosomen für den Abbau sequestriert.

Um die LDH-Sequestrierung zu beurteilen, die die autophagische Aktivität in großen Mengen widerspiegelt, wird eine Elektroporationsküvette mit nährstoffarmen Zellen entnommen, die mit Inhibitoren behandelt wurden, um den autophagisch-lysosomalen Abbau zu blockieren.

Führen Sie eine Elektroporation durch, um die Zellmembran selektiv aufzubrechen und lösliche Proteine freizusetzen.

Mischen Sie das Zellaufschlussmittel mit gepufferter Saccharoselösung, um die Zellbestandteile zu erhalten.

Übertragen Sie die erforderliche verdünnte Disruptatlösung in ein pufferhaltiges Röhrchen. Zentrifuge zur Trennung von nicht sequestriertem LDH von autophagosomensequestriertem LDH.

Übertragen Sie die verbleibende verdünnte Disruptatlösung, die die gesamte zelluläre LDH-Fraktion enthält, in ein anderes Röhrchen.

Geben Sie in beide Röhrchen einen nichtionischen tensidhaltigen Puffer, um sequestrierte und Gesamt-LDH-Fraktionen zu extrahieren.

LDH-haltige Überstände zentrifugieren und in pufferhaltige Röhrchen mit Pyruvat und NADH überführen.

LDH wandelt Pyruvat mit NADH-Oxidation in Laktat um, wodurch der NADH-Spiegel sinkt, der mit der LDH-Konzentration korreliert.

Quantifizierung von LDH in sedimentierten und gesamtzellulären Fraktionen, um die LDH-Sequestrierung zu bestimmen.

Resuspendieren Sie das Zellpellet mit einer Pipette, um eine Suspension nahezu mit einer einzigen Zelle zu erhalten. Übertragen Sie diese Suspension in eine 4-Millimeter-Elektroporationsküvette. Legen Sie die Küvette in einen Exponentialabklingwellen-Elektroporator und entladen Sie einen einzelnen elektrischen Impuls bei 800 Volt, 25 Mikrofarad und 400 Ohm.

Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze, um die Zelle, die sie aufbricht, in ein 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen, das 400 Mikroliter eiskalte, phosphatgepufferte Saccharoselösung enthält, und mischen Sie sie kurz durch Pipettieren. Wiederholen Sie diesen Resuspensions-, Elektrodenaufschluss- und Mischvorgang für jede Probe. Wenn Sie den Eingriff zum ersten Mal durchführen, stellen Sie sicher, dass die effiziente und selektive Unterbrechung der Plasmamembranelektrode wie im Text beschrieben überprüft wird.

Um sedimentierte LDH-Fraktionen zu erhalten, entfernen Sie 550 Mikroliter aus jeder verdünnten zellaufgeschlossenen Lösung und überführen Sie sie in ein eigenes 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 900 Mikroliter eiskalten Resuspensionspuffer mit 0,5 % BSA und 0,01 % Tween-20 enthält. Zum Mischen kurz pipettieren. Zentrifugieren Sie 45 Minuten lang bei 18.000 g und 4 Grad Celsius, um Pellets herzustellen, die sedimentiertes LDH enthalten. Saugen Sie den Überstand gründlich ab, um die Pellets so trocken wie möglich zu halten.

Lagern Sie die sedimentierten LDH-Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Analyse bereit sind. Für die Gesamt-LDH-Fraktionen werden 150 Mikroliter von jeder der verdünnten zellzertisierten Lösungen in ein eigenes neues Röhrchen überführt. Lagern Sie diese in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Analyse bereit sind.

Tauen Sie sowohl die sedimentierten LDH-Proben als auch die gesamten LDH-Proben auf dem Eis auf. Nach dem Auftauen werden 300 Mikroliter eiskalter Resuspensionspuffer mit 1,5 % Triton X-405 zu den gesamten LDH-Proben hinzugefügt. Drehen Sie die Proben auf einer Walze in einem Kühlraum für 30 Minuten. Geben Sie anschließend 750 Mikroliter eiskalten Resuspensionspuffer mit 1 % Triton X-405 zu den sedimentierten LDH-Proben. Verwenden Sie eine Pipette, um die Pellets wieder zu suspendieren, bis die Lösung homogen ist. Zentrifugieren Sie alle Proben fünf Minuten lang bei 18.000 g bei 4 Grad Celsius, um ungelöste Zelltrümmer zu sedimentieren.

Nachdem die Zentrifugation abgeschlossen ist, legen Sie die Proben auf Eis. Bestimmen Sie die LDH-Spiegel in den Überständen entweder mit einem klassischen enzymatischen Assay, wie im Text beschrieben, oder mit einem der zahlreichen kommerziell erhältlichen Kits.