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Immunologie
0 Aufrufe • 4:33 Min. • July 8th, 2025
Bei der Bulk-Autophagie werden autophagische Fracht und lösliche zytosolische Proteine, einschließlich Laktatdehydrogenase oder LDH, in Autophagosomen für den Abbau sequestriert.
Um die LDH-Sequestrierung zu beurteilen, die die autophagische Aktivität in großen Mengen widerspiegelt, wird eine Elektroporationsküvette mit nährstoffarmen Zellen entnommen, die mit Inhibitoren behandelt wurden, um den autophagisch-lysosomalen Abbau zu blockieren.
Führen Sie eine Elektroporation durch, um die Zellmembran selektiv aufzubrechen und lösliche Proteine freizusetzen.
Mischen Sie das Zellaufschlussmittel mit gepufferter Saccharoselösung, um die Zellbestandteile zu erhalten.
Übertragen Sie die erforderliche verdünnte Disruptatlösung in ein pufferhaltiges Röhrchen. Zentrifuge zur Trennung von nicht sequestriertem LDH von autophagosomensequestriertem LDH.
Übertragen Sie die verbleibende verdünnte Disruptatlösung, die die gesamte zelluläre LDH-Fraktion enthält, in ein anderes Röhrchen.
Geben Sie in beide Röhrchen einen nichtionischen tensidhaltigen Puffer, um sequestrierte und Gesamt-LDH-Fraktionen zu extrahieren.
LDH-haltige Überstände zentrifugieren und in pufferhaltige Röhrchen mit Pyruvat und N
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