JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 3:53 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Multiwell-Platte mit verschiedenen Reportermakrophagen, die das sekretierte embryonale alkalische Phosphatase-Gen (SEAP) oder ein sezerniertes Luciferase-Gen unter induzierbaren Promotoren beherbergen.
Medien, die verschiedene Peptid-Gold-Nanopartikel-Hybride enthalten, die mit Lipopolysacchariden oder LPS gemischt sind, sind in die dafür vorgesehenen Vertiefungen zu geben.
LPS bindet an Makrophagen-Toll-like-Rezeptoren (TLR) und löst die Internalisierung in das Endosom aus.
Die endosomale Protonenpumpe transportiert Protonen im Inneren. Die Versauerung löst die TLR-Signalgebung aus und aktiviert so Transkriptionsfaktoren.
Diese Faktoren induzieren die Expression der Reportergene und produzieren SEAP oder Luciferase.
Alternativ bewirkt die Internalisierung von LPS zusammen mit den Hybriden, dass die negativ geladenen Peptidgruppen luminale Protonen sequestrieren, wodurch eine endosomale Ansäuerung verhindert und die TLR-Signalübertragung gehemmt wird.
Sammeln Sie das Medium, zentrifugieren Sie, um den Überstand zu trennen, und fügen Sie Substrate für SEAP und Luciferase hinzu.
SEAP wandelt sein Substrat in ein farbiges Produkt um, während Luciferase sein Substrat katalysiert, um Lumineszenz zu erzeugen.
Eine Verringerung der Reportersignale deutet auf die Wirksamkeit der Hybride bei der Hemmung des TLR-Signalwegs hin.
Zentrifugieren Sie 20 Volumina der Peptid-GNP-Hybridlösung in 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen bei 18.000 g für 30 Minuten. Entsorgen Sie die Überstände vorsichtig. Füllen Sie die Hybriden in eine einzige frische Tube und waschen Sie sie zweimal mit 1 Milliliter PBS. Danach resuspendieren Sie die gewaschenen Hybriden in einem Volumen R10-Medium. Mischen Sie gleiche Volumina der konzentrierten Hybriden und des LPS-haltigen R10-Mediums so, dass die Endkonzentration der Hybriden und des LPS 100 hundert Nanomolar bzw. 10 Nanogramm pro Milliliter beträgt.
Entfernen Sie anschließend das Nährmedium von der Makrophagen-Kulturplatte. Geben Sie 100 Mikroliter des Hybrid-LPS-Gemisches in jede Vertiefung mit drei Replikaten für jede Erkrankung. Fügen Sie eine Negativkontrolle und eine LPS-Kontrolle hinzu. Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und geben Sie dann das Medium jeder Vertiefung in ein separates Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 18.000 mal g bei 4 Grad Celsius für 30 Minuten. Übertragen Sie die Überstände in eine frische runde Bodenplatte mit 96 Vertiefungen.
Um mit dem Reporter-Assay an diesen Proben zu beginnen, geben Sie 180 Mikroliter vorgewärmte QUANTI-Blue-Lösung in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte mit flachem Boden und übertragen Sie dann 20 Mikroliter der Überstände aus jeder Probe in diese Platte. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden, bis sich die dunkelblaue Farbe zu einer optischen Dichte von über 1 entwickelt. Danach wird die Absorption mit einem Plattenleser bei 655 Nanometern aufgezeichnet. Übertragen Sie als Nächstes 10 Mikroliter frischen Überstand von jeder Probe in eine 96-Well-Platte mit klarem flachem Boden.
Geben Sie mit einem automatischen Injektor 50 Mikroliter der Luciferase-Lösung in jede Vertiefung und zeichnen Sie die Lumineszenz sofort Vertiefung für Vertiefung auf. Validieren Sie dann die inhibitorische Wirkung der potenziellen Kandidaten und bewerten Sie die TLR-Spezifität, wie im Textprotokoll beschrieben.