Ein fokusbildender Assay zur Quantifizierung von Virustitern in den Organen einer infizierten Maus

Nehmen Sie eine Multiwell-Platte, die eine Monoschicht aus Säugetierzellen enthält.

Beimpfen Sie die Vertiefungen mit seriellen Verdünnungen von Gewebehomogenaten, die das Zika-Virus enthalten und aus verschiedenen Organen einer infizierten Maus stammen.

Beim Eintritt in die Zellen über die Endozytose vermehrt sich das Virus und knospt ab, um benachbarte Zellen zu infizieren.

Mit einer hochviskosen Methylcelluloselösung überziehen, wodurch eine physikalische Barriere entsteht, die die Virusbewegung einschränkt.

Die Barriere erlaubt nur die Infektion unmittelbarer Nachbarzellen, wodurch sich Herde infizierter Zellen bilden, und stellt sicher, dass jeder Fokus von einem einzigen Viruspartikel stammt, was eine genaue Quantifizierung ermöglicht.

Fixieren Sie die Zellen und permeabilisieren Sie die Membran. Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die in die Zellen eindringen und mit dem viralen Antigen interagieren.

Führen Sie einen Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper ein, der an den Primärantikörper bindet.

Fügen Sie ein chromogenes Substrat hinzu, das durch Peroxidase umgewandelt wird, um farbige Flecken zu erzeugen, die auf die Herde infizierter Zellen hinweisen.

Zählen Sie die Herde, um den Virustiter in den verschiedenen Organen der Maus zu quantifizieren.

Nehmen Sie die homogenisierten Proben aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und lassen Sie sie auftauen. Während die Proben auf Eis sind, verdünnen Sie das Zika-Virus 10-fach in die erste Vertiefung der Verdünnungsplatte und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10-fache serielle Verdünnungen auf der Platte durchzuführen, wobei Sie jedes Mal die Spitzen wechseln, indem Sie 20 Mikroliter Probe in 180 Mikroliter Wachstumsmedium geben.

Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen jeder Verdünnung. Bereiten Sie die Fokusformungsplatte vor, indem Sie das Medium von der vorbereiteten 96-Well-Platte mit flachem Boden entfernen, die die Vero-Zellen abdeckt. Um ein Austrocknen der Monoschicht zu verhindern, geben Sie sofort 100 Mikroliter der Virusverdünnung in jede Vertiefung in der Vero-Platte. Verwenden Sie die gleichen Spitzen, um von der niedrigsten zur höchsten Konzentration hinzuzufügen.

Gesteinsplatten 2 bis 4 Mal nebeneinander legen und ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. 2% Methylcellulose auf Raumtemperatur erwärmen. Verdünnen Sie dann die 2%ige Methylcelluloselösung in Wachstumsmedien in einem Verhältnis von etwa 2 zu 1. Geben Sie nach der Inkubation 125 Mikroliter des Methylcellulose-Wachstumsmediums in jede Vertiefung der 96-Well-Platten. Inkubieren Sie erneut bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 32 bis 40 Stunden.

Um die Vero-Zellen in einer Biosicherheitswerkbank zu fixieren, geben Sie 50 Mikroliter 5 % Paraformaldehyd über die Methylcelluloseschicht in jeder Vertiefung der 96-Well-Platten. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Alternativ können Sie die Platten mit Parafilm abdecken und über Nacht bei 4 Grad Celsius aufstellen.

Entfernen Sie danach mit einer Pipette die Überlagerung und das Medium von den Zellen in einen Einwegbehälter in der Biosicherheitswerkbank. Vorsichtig mit 150 Mikrolitern PBS pro Vertiefung waschen. Entfernen Sie PBS von den Platten und entfernen Sie die Platte aus der Biosicherheitswerkbank. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche zweimal. Fügen Sie dann 150 Mikroliter pro Vertiefung einmal FFA-Waschpuffer hinzu und lassen Sie es 5 bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die fixierten Zellen zu permeabilisieren.

Verwenden Sie als Nächstes einen primären Zika-Antikörper, um eine Infektion nachzuweisen. Bereiten Sie den Primärantikörper 4G2 in einer Konzentration von 1 Mikrogramm pro Milliliter in FFA-Färbepuffer vor. Streichen Sie den FFA-Waschpuffer von den Platten und geben Sie 50 Mikroliter des primären Antikörpers in FFA-Färbepuffer in jede Vertiefung. Versiegeln Sie dann die Platten mit Parafilm oder Plastikfolie und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Bereiten Sie den sekundären Ziegen-Anti-Maus-HRP-markierten Antikörper in einer Konzentration von 1 bis 5.000 in FFA-Färbepuffer vor. Nach dem Entfernen der Antikörperlösung die Zellen dreimal mit 150 Mikrolitern FFA-Waschpuffer pro Vertiefung waschen. Entfernen Sie den Waschpuffer, indem Sie jedes Mal in das Waschbecken schnippen.

Färben Sie die Zellen mit dem Sekundärantikörper in FFA-Färbepuffer bei 50 Mikrolitern pro Vertiefung und inkubieren Sie sie ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie danach die Zellen erneut dreimal mit FFA-Waschpuffer und entfernen Sie den Waschpuffer, indem Sie ihn jedes Mal in die Spüle schnippen.

Geben Sie 50 Mikroliter des Trueblue-Substrats in jede Vertiefung. Warten Sie 2 bis 15 Minuten, bis die Spots mit minimalem Hintergrund vollständig definiert sind. Nachdem die Flecken sichtbar sind, waschen Sie sie vorsichtig mit einer Hand mit Wasser, um die Monoschicht vor der Kraft des fließenden Wassers zu schützen. Auf Küchenpapier mit dem Klopf trocknen.

Verwenden Sie kurz darauf ein Präpariergerät, um die Spots in jeder Vertiefung manuell zu zählen, oder verwenden Sie einen automatischen Spotzähler. Wählen Sie in der Immunerfassungssoftware eine Verdünnung mit leicht unterscheidbaren Foki zwischen 20 und 200 pro Vertiefung für jede Probe und berechnen Sie den Titer in fokusbildenden Einheiten pro Milliliter anhand des Durchschnitts der doppelten Vertiefungen.