Die Auswirkungen von Scherstress auf Blutplättchen, die mit Antikörpern gegen mechanosensorische Rezeptoren behandelt wurden

Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte mit plättchenreichem Plasma. Blutplättchen exprimieren Oberflächen-Mechanorezeptor-Komplexe, die auf mechanische Reize reagieren.

Der Mechanorezeptor-Komplex enthält die extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne und die Makroglykopeptidregion, die mit der mechanosensorischen Domäne verbunden ist.

Einführung von Anti-Mechanorezeptor-Antikörpern, die sich mit den Ligandenbindungsdomänen der Rezeptoren auf gegenüberliegenden Blutplättchen vernetzen.

Ein Tröpfchen der mit Antikörpern behandelten Plasmasuspension wird zwischen die Baugruppen des Viskosimeters gelegt.

Wenden Sie Scherspannung an, simulieren Sie mechanische Kraft, ziehen Sie die Antikörper-gebundenen Rezeptoren von den Blutplättchen weg, was zu einer Dissoziation der Makro-Glykopeptid-Region von der mechanosensorischen Domäne führt.

Dies löst eine Konformationsänderung im mechanosensorischen Bereich aus, die Blutplättchen aktiviert und zur Expression von Oberflächenmarkern führt.

Übertragen Sie die gescherte Thrombozytensuspension in eine neue Vertiefung innerhalb der Multiwell-Platte.

Führen Sie einen Cocktail aus Fluorophor-markierten Marker-spezifischen Molekülen ein, die mit den entsprechenden Thrombozytenoberflächenmarkern interagieren, und fixieren Sie die Zellen mit einer Fixierlösung.

In der Durchflusszytometrie korrelieren unterschiedliche Fluoreszenzsignale mit den Auswirkungen von Scherstress auf Antikörper-behandelte Blutplättchen.

Fügen Sie für die Ligandenbehandlung langsam den Antikörper oder Liganden von Interesse zum plättchenreichen Plasma hinzu und mischen Sie die Blutplättchen vorsichtig. Schalten Sie während der Inkubation das Kegel-Platte-Viskosimeter ein und stellen Sie die Plattentemperatur auf 22 Grad Celsius ein. Nach 5 bis 10 Minuten wird das behandelte plättchenreiche Plasma direkt in der Mitte der Platte auf das temperaturgesteuerte Kegel-Platte-Viskosimeter übertragen, wobei darauf zu achten ist, dass sich die gesamte Probe an der Kontaktstelle zwischen Kegel und Platte ablagert.

Um eine Scherung auf die Probe anzuwenden, berechnen Sie die Scherung gemäß dem Handbuch des Viskosimeters und wenden Sie die Scherung mit der entsprechenden Geschwindigkeit und Dauer auf die Probe an. Heben Sie am Ende der Anwendung den Kegel etwa 2 Millimeter von der Platte ab, so dass die Probe sowohl mit der Platte als auch mit dem Kegel in Kontakt bleibt, und verwenden Sie eine Pipettenspitze mit Gelladefunktion, um 5 bis 10 Mikroliter von der Mitte des Probenvolumens zu sammeln. Inkubieren Sie dann die gescherte Probe 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Antikörpern gegen die interessierenden Oberflächenmarker und fixieren Sie die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2 % Paraformaldehyd.

Um die Proben mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, sammeln Sie mindestens 20.000 Ereignisse für jede Bedingung und quantifizieren Sie die Signalstärke jedes Fluoreszenzmarkers anhand des Höhenwerts für die Intensität jedes Fluorophors. Verwenden Sie dann eine Negativkontrolle mit Rinderserumalbumin oder Vehikel, um ein Gate zu zeichnen, das negative Hintergrundfluoreszenzereignisse ausschließt, und quantifizieren Sie den Prozentsatz der Ereignisse innerhalb des Gates für alle Versuchsbedingungen.