Ein in vitro Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in Makrophagen

Nehmen Sie zwei Mikrotiterplatten mit Deckgläsern mit Makrophagen oder BMMs aus dem Knochenmark.

Fügen Sie die metazyklischen Promastigoten von Leishmania – das längliche gegeißelte Stadium – in eine Platte und Amastigotes – das ovale, nicht gegeißelte Stadium – in eine andere Platte hinzu.

Während der Inkubation binden die Parasiten an Makrophagenrezeptoren und lösen so die Rezeptor-vermittelte Phagozytose aus.

Das Phagosom verschmilzt mit den Lysosomen und Vesikel, die aus dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat stammen, und reift zu einer parasitophoren Vakuole.

Der verringerte pH-Wert der Vakuole löst die Differenzierung der Promastigoten in Amastigot und deren Replikation aus.

Waschen, um nicht internalisierte Parasiten zu entfernen.

Fixieren Sie die infizierten Makrophagen und fügen Sie Reinigungsmittel hinzu, um die Zellen und Parasiten zu permeabilisieren.

Führen Sie einen fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff ein, um die Makrophagen- und Parasitenkerne zu färben.

Montieren Sie die Deckgläser auf Objektträger und beobachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop, wobei Sie die größeren Wirtskerne und die umgebenden kleineren Amastigotenkerne quantifizieren.

Vergleichen Sie die Anzahl der Amastigoten, um ihre Vermehrung innerhalb von Makrophagen, die ursprünglich mit undifferenzierten Promastigoten infiziert waren, mit denen zu bewerten, die mit replikativen Amastigoten infiziert waren.

Um die Zellen mit L. amazonensis zu infizieren, verdünnen Sie die Parasitensuspension auf die entsprechende experimentelle Infektionsvielfalt und fügen Sie 50 bis 100 Mikroliter Parasiten zu jeder Vertiefung aller 6-Well-Platten hinzu, einschließlich aller Zeitpunkte des Experiments. Inkubieren Sie die aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen für die entsprechende Infektionsdauer und -temperatur. Waschen Sie dann die Vertiefungen dreimal mit 2 Millilitern frischem 37 Grad Celsius PBS ohne Kalzium oder Magnesium pro Vertiefung und fixieren Sie die anfänglichen Proben zum Zeitpunkt 10 Minuten lang mit 1,5 bis 2 Millilitern 2%igem Paraformaldehyd

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Für die Platten, die den späteren Zeitpunkten entsprechen, geben Sie 2 Milliliter frisches Makrophagenmedium aus dem Knochenmark in jede Vertiefung und geben Sie die Platten wieder in den entsprechenden Inkubator. Fixieren und waschen Sie dann die Zellen für jeden verbleibenden Zeitpunkt, wie gerade gezeigt, und lagern Sie die Proben bei 4 Grad Celsius in frischem PBS.

Um die Zellen mit DAPI zu färben, ersetzen Sie den Überstand durch 1,5 Milliliter frisches PBS ohne Kalzium und Magnesium, ergänzt mit 0,1 % nichtionischem Reinigungsmittel für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von drei 2-Milliliter-Waschgängen mit PBS ohne Kalzium oder Magnesium. Anschließend färben Sie die Zellen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 2 Mikrogramm pro Milliliter DAPI in 1 Milliliter PBS.

Legen Sie die Deckgläser nach drei Wäschen mit der Zellseite nach unten auf einzelne Glasobjektträger, die mit einem handelsüblichen Anti-Fade-Einbettreagenz montiert sind. Um die Anzahl der infizierten Zellen zu quantifizieren, verwenden Sie dann das 100-fache Immersionsölobjektiv eines Fluoreszenzmikroskops und eines Emanuel-Zählers, um die Anzahl der kleineren Amastigotenkerne zu identifizieren, die sich um jeden großen DAPI-gefärbten Makrophagenkern gruppieren.