JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 2:20 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Multiwell-Platte, die serielle Verdünnungen der Testverbindung, eines Aminoglykosid-Antibiotikums, enthält.
Geben Sie eine Suspension von Mycobacterium tuberculosis – einem pathogenen Bakterium – in die Vertiefungen und inkubieren Sie.
Im Zytoplasma bindet die Testsubstanz an die mykobakterielle ribosomale 30S-Untereinheit, hemmt die normale Proteinsynthese und führt schließlich zum Tod der Mykobakterien.
Fügen Sie den Kulturen nach der Inkubation Resazurin hinzu – einen schwach fluoreszierenden wasserlöslichen Farbstoff. Ausbrüten.
In lebensfähigen metabolisch aktiven Mykobakterien reduzieren Dehydrogenase-Enzyme blau gefärbtes Resazurin zu einem rosa fluoreszierenden Resorufin.
Messen Sie mit einem Fluoreszenzplatten-Reader die Resorufin-Fluoreszenzintensität in den Wells.
Ein niedriger Fluoreszenzintensitätswert mit steigenden Konzentrationen der Prüfsubstanz deutet auf eine zytotoxische Wirkung gegen die Mykobakterien hin.
Um einen Resazurin-Assay durchzuführen, züchten Sie M. tuberculosis in der 7H9ADST bis zur mittleren logarithmischen Phase. Verdünnen Sie die Kultur mit 7H9ADST auf einen OD600 von 0,01. Verwenden Sie 7H9ADST, um die Verbindungen auf das Doppelte der Prüfkonzentrationen zu verdünnen, und aliquotieren Sie 100 Mikroliter jeder verdünnten Verbindung in jede Vertiefung einer durchsichtigen 96-Well-Platte.
Übertragen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Bakteriensuspension in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator für 5 Tage. Lösen Sie 10 Milligramm Resazurin in 100 Millilitern entionisiertem Wasser auf und sterilisieren Sie die Lösung. Geben Sie 30 Mikroliter Resazurinlösung in die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Zellen dann 48 Stunden lang.
Das Bakterienwachstum wird durch eine Farbumwandlung von Blau nach Rosa angezeigt. Führen Sie eine quantitative Analyse gemäß dem Textprotokoll durch.