JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 4:34 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Mikroplatte mit Säugetierzellen auf Eis.
Geben Sie ein kalziumhaltiges Medium in ausgewählte Vertiefungen und ein kalziumfreies Medium in die anderen.
Monomere eines bakteriellen porenbildenden Toxins einführen. Eine niedrige Temperatur verhindert die Aggregation von Monomeren und erleichtert die Bindung an das Cholesterin der Zellmembran.
Inkubieren Sie bei einer physiologischen Temperatur, so dass die cholesteringebundenen Monomere oligomerisieren und in die Membran eindringen können, wodurch eine Pore entsteht.
In Vertiefungen mit extrazellulärem Kalzium verursacht die Pore einen Kalziumeinstrom.
Der Einstrom löst die exosomale Ausscheidung des Toxins und die Wiederversiegelung der Membran aus.
Der intrazelluläre Kalziumanstieg induziert auch eine lysosomale Exozytose, wobei ein Enzym freigesetzt wird, das das Sphingomyelin der Membran in Ceramid umwandelt.
Die mit Ceramiden angereicherte Membran löst die Toxin-Endozytose aus und versiegelt die Membran wieder.
Die Wiederversiegelung der Membran wird in Vertiefungen ohne extrazelluläres Kalzium behindert.
Fügen Sie Propidiumiodid oder PI hinzu – einen Fluoreszenzfarbstoff –, der nicht in Zellen mit einer repariert
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