Ein in vitro fluoreszenzbasierter Assay zur Messung der Effizienz der Wiederversiegelung von Plasmamembranen

Nehmen Sie eine Mikroplatte mit Säugetierzellen auf Eis.

Geben Sie ein kalziumhaltiges Medium in ausgewählte Vertiefungen und ein kalziumfreies Medium in die anderen.

Monomere eines bakteriellen porenbildenden Toxins einführen. Eine niedrige Temperatur verhindert die Aggregation von Monomeren und erleichtert die Bindung an das Cholesterin der Zellmembran.

Inkubieren Sie bei einer physiologischen Temperatur, so dass die cholesteringebundenen Monomere oligomerisieren und in die Membran eindringen können, wodurch eine Pore entsteht.

In Vertiefungen mit extrazellulärem Kalzium verursacht die Pore einen Kalziumeinstrom.

Der Einstrom löst die exosomale Ausscheidung des Toxins und die Wiederversiegelung der Membran aus.

Der intrazelluläre Kalziumanstieg induziert auch eine lysosomale Exozytose, wobei ein Enzym freigesetzt wird, das das Sphingomyelin der Membran in Ceramid umwandelt.

Die mit Ceramiden angereicherte Membran löst die Toxin-Endozytose aus und versiegelt die Membran wieder.

Die Wiederversiegelung der Membran wird in Vertiefungen ohne extrazelluläres Kalzium behindert.

Fügen Sie Propidiumiodid oder PI hinzu – einen Fluoreszenzfarbstoff –, der nicht in Zellen mit einer reparierten Membran eindringen kann, aber in beschädigte Zellen eindringt, um DNA zu binden und Fluoreszenz zu emittieren.

Messen Sie die Fluoreszenz in definierten Intervallen, um die Effizienz der Membranwiederversiegelung zu beurteilen.

Um einen fluoreszenzbasierten Hochdurchsatz-Assay für die reparaturpermissiven Bedingungen einzurichten, waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern 37 Grad Celsius M1 Medium pro Vertiefung und fügen Sie 100 Mikroliter frisches 37 Grad Celsius M1 Medium hinzu, das mit 30-mikromolarem Propidiumiodid ergänzt wird, nachdem Sie die zweite Wäsche verworfen haben.

Waschen Sie die Zellen bei Reparaturen einmal mit 200 Mikrolitern 37 Grad Celsius M2 Medium, ergänzt mit 5-Millimolar EGTA pro Well, gefolgt von einer Wäsche mit 200 Mikrolitern M2 Medium allein.

Nachdem Sie die zweite Wäsche verworfen haben, fügen Sie 100 Mikroliter frisches Medium mit 37 Grad Celsius M2 hinzu, das mit 30 mikromolaren Propidiumiodid pro Vertiefung ergänzt wird. Bilden Sie dann die Platte unter Durchlicht, GFP und PI ab, wie gerade gezeigt. Während die Platte abgebildet wird, legen Sie eine 96-Well-Mikroplatte aus Polypropylen mit rundem Boden auf Eis und konfigurieren Sie die Platte wie gerade für die vorherige Platte gezeigt.

Für reparaturfreundliche Bedingungen fügen Sie 100 Mikroliter eiskaltes M1-Medium hinzu, das mit 60 mikromolaren Propidiumiodid pro Vertiefung ergänzt wird, gefolgt von der Zugabe von 100 Mikrolitern eiskaltem M1 mit oder ohne 4x Listeriolysin O pro Vertiefung.

Für reparaturrestriktive Bedingungen fügen Sie 100 Mikroliter eiskaltes M2-Medium hinzu, ergänzt mit 60 mikromolaren Propidiumiodid, gefolgt von der Zugabe von 100 Mikrolitern eiskaltem M2 mit oder ohne 4x Listeriolysin O pro Vertiefung.

Es ist zwingend erforderlich, Listeriolysin O in der entsprechenden experimentellen Konzentration auf Eis etwa 5 Minuten vor Beginn des kinetischen Assays herzustellen, wenn Platte 1 auf Eis liegt und Platte 2 vorbereitet wird.

Wenn die erste Platte fertig abgebildet ist, übertragen Sie die Platte sofort auf ein Blatt Aluminiumfolie auf Eis. Übertragen Sie nach 5 Minuten 100 Mikroliter aus jeder Vertiefung der zweiten Platte in die entsprechende Vertiefung in der ersten abgekühlten Platte, indem Sie die Pipettenspitzen unterhalb des Lösungsmeniskus in jede Vertiefung einführen, bevor Sie das Volumen ohne Mischen ausstoßen, um das Toxin richtig zu verteilen.

Lassen Sie das Toxin 1 Minute lang an die Wirtszellen binden und übertragen Sie die erste Platte sofort auf den Plattenleser für den postkinetischen Assay im Spektrofluorometer-Modus. Am Ende des kinetischen Assays ist sofort eine postkinetische Bildgebung des Plattenbildes zu erstellen, wie sie für die präkinetische Bildgebung gezeigt wurde.