Ein Assay für die Zellzyklusanalyse von antigenspezifischen CD8⁺ T-Zellen

Nehmen Sie sekundäre lymphoide Organzellen einer antigenimmunisierten Maus, die antigenspezifische CD8⁺ T-Zellen in verschiedenen Zellzyklusstadien enthalten.

G₁, S, G₂ und M sind Stadien aktiv teilender Zellen, während Zellen im G_0-Stadium ruhen

.

Fügen Sie einen fluoreszierenden Viabilitätsfarbstoff hinzu, um tote Zellen zu markieren, und Fluorophor-markierte Antikörper, die an die T-Zell-Oberflächenmarker CD3 und CD8 binden.

Einführung von Fluorophor-konjugierten antigenen Peptid-MHC-Multimeren zur Bindung von T-Zell-Rezeptoren und zur Markierung der antigenspezifischen T-Zellen.

Fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen mit einem Puffer.

Führen Sie Fluorophor-markierte Antikörper ein, um ein Zellproliferations-assoziiertes Kernprotein zu binden und die sich aktiv teilenden Zellen zu färben.

Füge einen Fluoreszenzfleck hinzu, um die DNA zu markieren.

Mittels Durchflusszytometrie werden die lebenden Zellen selektiert und die antigenspezifischen CD8⁺ T-Zellen über die oberflächengebundenen Markierungen identifiziert.

Die Intensität der DNA-Färbung unterscheidet_G0- und_G1-Zellen mit einer niedrigeren DNA-Menge von den S-,_G2- und M-Zellen mit einer höheren DNA-Menge. Das Fehlen des nukleären Protein-spezifischen Antikörpers trennt die G_0-Zellen.

Bereiten Sie frischen 1X-Permeabilisierungs-Waschpuffer vor, indem Sie den 10-fachen Permeabilisierungspuffer mit destilliertem Wasser verdünnen und durch einen 0,45-Mikrometer-Filter filtrieren, um Aggregate zu entfernen. Der monoklonale Antikörper Ki67-FITC wird in 1-fachem Permeabilisierungs-Waschpuffer verdünnt, wie mit einem Titrationsexperiment für ein Endvolumen von 100 Mikrolitern pro Probe bestimmt.

Geben Sie 3 Milliliter des 1X Permeabilisierungs-Waschpuffers in jedes Röhrchen mit den Zellen und zentrifugieren Sie es bei 400 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie erneut den 1X-Permeabilisierungswaschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren, und verwerfen Sie dann den Überstand.

Geben Sie 100 Mikroliter des verdünnten monoklonalen Antikörpers Ki67-FITC in das Pellet, dann vortexen und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit 4 Millilitern 1X Permeabilisierungspuffer, zentrifugieren Sie sie nach jedem Waschen und entsorgen Sie den Überstand.

Geben Sie 350 Mikroliter PBS in das Zellpellet für Proben, die direkt am Durchflusszytometer entnommen werden, und 250 Mikroliter PBS in das Zellpellet für Proben, die mit Hoechst zur DNA-Färbung inkubiert werden sollen. Bereiten Sie die Hoechst- und PBS-Lösung vor und fügen Sie sie jeder Probe hinzu, so dass die Endkonzentration 2 Mikrogramm pro Milliliter beträgt. Vortex und inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang im Dunkeln. Zentrifugieren Sie dann die Proben 5 Minuten lang und fügen Sie dem Zellpellet 350 Mikroliter PBS hinzu.

Öffnen Sie die Software und erstellen Sie verschiedene Gruppen, die den verschiedenen zu analysierenden Organen entsprechen, indem Sie im Menüband des Arbeitsbereichs auf Gruppe erstellen klicken. Öffnen Sie das Fenster Gruppe ändern mit einem Doppelklick auf den Gruppennamen und synchronisieren Sie die neu erstellten Gruppen, indem Sie ein Häkchen bei der Funktion Synchronisiert setzen.

Ziehen Sie jede FCS-Datei in die entsprechende Gruppe und erstellen Sie dann eine Anschnittstrategie, die mit der Gruppe "Bis LN" beginnt. Öffnen Sie das Diagrammfenster, indem Sie auf die vollständig gefärbte Probe doppelklicken, um die für diese Probe erfassten ungatierten Ereignisse in einem Punktdiagramm anzuzeigen. Beachten Sie, dass die x- und y-Achse wie in den FCS-Dateien beschriftet sind, wie in Tabelle 2 der Datei mit den Durchflusszytometer-Einstellungen dieses Manuskripts angegeben. Stellen Sie sicher, dass eine ausreichende Anzahl von Ereignissen für eine geeignete Visualisierung angezeigt wird.

Öffnen Sie bei Bedarf die Einstellungen, indem Sie auf das Herzsymbol im Menüband des Arbeitsbereichs klicken, Diagramme und dann Punktdiagramm als Diagrammtyp auswählen und überprüfen, ob die Anzahl der im entsprechenden Feld gezeichneten Punkte korrekt ist, oder ändern Sie sie. Zeigen Sie die nicht gespeicherten Ereignisse im Diagrammfenster in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und DNA-W auf der y-Achse an. Verwenden Sie eine lineare Skalierung für beide Achsen. Ändern Sie bei Bedarf die Skala von logarithmisch auf linear, indem Sie auf das Kästchen klicken, das mit einem T in der Nähe jeder Achse im Diagrammfenster angezeigt wird.

Wählen Sie eine einzelne Zellpopulation aus, indem Sie im Abschnitt Gating Tools auf Rechteck klicken, und doppelklicken Sie dann in die Mitte des rechteckigen Tors, um einzelne Zellen in einem Punktdiagramm mit dem FSC-A-Parameter auf der x-Achse und dem Farbstoff für tote Zellen auf der y-Achse anzuzeigen.

Klicken Sie auf das Polygon, um die lebende Zellpopulation auszuwählen, die negativ für den Farbstoff toter Zellen ist. Doppelklicken Sie in die Mitte des Polygon-Gates, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit dem Parameter FSC-A auf der x-Achse und dem SSC-A-Parameter auf der y-Achse anzuzeigen.

Klicken Sie auf Rechteck und erstellen Sie ein "entspanntes" Gate, um alle einzelnen lebenden Zellen in dieses Diagramm einzubeziehen. Doppelklicken Sie in die Mitte des entspannten Gates, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit CD3 auf der x-Achse und CD8 auf der y-Achse anzuzeigen.

Verwenden Sie die entsprechende Achsenskala für die Visualisierung im Diagrammfenster. Ändern Sie bei Bedarf die x- und y-Skala, indem Sie auf das Feld klicken, das mit einem T in der Nähe jeder Achse gekennzeichnet ist. Wählen Sie Axis Function anpassen aus, und ändern Sie nach Bedarf die zusätzlichen Neg-Dekaden, die Breitenbasis und die positiven Dekaden.

Wählen Sie die CD3-positiven, CD8-positiven Zellen aus, indem Sie auf Polygon klicken. Doppelklicken Sie in die Mitte des CD3-positiven, CD8-positiven Gatters, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit Tetr-Gag auf der x-Achse und Pent-Gag auf der y-Achse anzuzeigen. Wählen Sie die antigenspezifischen CD8 T-Zellen aus, indem Sie auf Polygon klicken. Doppelklicken Sie in die Mitte des gagspezifischen Gates, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und Ki67 auf der y-Achse anzuzeigen. Wählen Sie die Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen aus, indem Sie im Abschnitt Gating Tools des Diagrammfensters auf Quad klicken.