Warum ist die Nullhypothesentestung für die Quantifizierung der Mikroglia-Aufnahme wichtig?

Die Nullhypothesenprüfung stellt sicher, dass beobachtete Unterschiede in der mikroglialen Phagozytose statistisch signifikant sind, was eine robuste Target-Validierung unterstützt und falsch-positive Ergebnisse in der frühen Entdeckungsphase reduziert.

Wie passt die Isolierung der unabhängigen Variablen in den Ablauf der Durchflusszytometrie ein?

Die Isolierung von Variablen wie Zelltyp und Vitalität durch spezifische Antikörperfärbung und Gating ermöglicht eine präzise Zuordnung phagozytischer Aktivität zu Mikroglia und stärkt damit die mechanistischen Erkenntnisse.

Was ermöglichen quantitative Messungen der abhängigen Variablen in diesem Assay?

Quantitative Fluoreszenzmessungen ermöglichen einen direkten Vergleich der Mikroglia-Aufnahme unter verschiedenen Bedingungen und erleichtern datengestützte Entscheidungen bei der Screening- und Zielstrukturpriorisierung.

Warum sind Replikationsanforderungen für die Zusammenarbeit über Fachbereiche hinweg entscheidend?

Die Reproduktion von Durchflusszytometrie-Ergebnissen über Experimente und Teams hinweg gewährleistet die Reproduzierbarkeit und ermöglicht den zuverlässigen Austausch von Daten sowie deren Integration in umfassendere Forschungs- und Entwicklungsarbeitsabläufe.

Welche statistischen Analysefähigkeiten sind erforderlich, bevor Durchflusszytometrie-Auslesemethoden implementiert werden?

Zur Analyse multiparametrischer Durchflusszytometriedaten, Beurteilung der Signifikanz und Validierung der Ergebnisse für nachgeschaltete Entscheidungsprozesse in biopharmazeutischen Entwicklungsstufen sind robuste statistische Werkzeuge erforderlich.

Messung der Mikrogliaaufnahme von intravitreal abgegebenen fluoreszierenden Partikeln mittels Durchflusszytometrie

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 Ansichten • 4:34 Min. • July 8th, 2025

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Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die eine Einzelzellsuspension von myeloischen Zellen der Maus-Netzhaut, einschließlich Mikroglia, Monozyten und Neutrophilen, enthält.

Mikroglia – oder phagozytäre Immunzellen der Netzhaut – weisen eine Fluoreszenz auf, die auf verschlungene, mit Fluorophoren markierte Biopartikel pilzlichen Ursprungs zurückzuführen ist, die intravitreal vorinjiziert werden.

Zentrifugieren und fügen Sie Fc-Rezeptor-Antikörper hinzu, um unspezifische Interaktionsstellen zu blockieren."

Einführung eines Cocktails aus Fluorophor-markierten Antikörpern, die auf CD11b-, Ly6C- und Ly6G-Oberflächenproteine abzielen und mit myeloischen Zellen interagieren, die diese exprimieren.

Entfernen Sie ungebundene Antikörper. Behandeln Sie mit Propidiumiodid, das durch geschädigte Membranen dringt und ausschließlich abgestorbene Zellen färbt.

In der Durchflusszytometrie wird Propidiumiodid angeregt, um tote Zellen auszuschließen und die nicht fluoreszierenden lebenden Zellen zu identifizieren.

Beleuchten Sie die Zellen mit einem violetten Laser; angeregte lebende Zellen stehen für die CD11b-exprimierenden myeloischen Zellen.

Als nächstes wird das Licht mit einem roten Laser angeregt, um das nahezu fernrote Fluorophor in CD11b-positiven Zellen anzuregen, was auf Ly6C-exprimierende Monozyten und Ly6G-exprimierende Neutrophile hinweist.

Stimulieren Sie die Zellen mit einem blauen Laser; die Emission von grüner Fluoreszenz aus den verbleibenden CD11b-positiven Zellen bestätigt die Mikrogliaaufnahme von fluoreszierenden Partikeln.

Drei Stunden nach der intravitrealen Injektion drücken Sie mit einer Pinzette im 45-Grad-Winkel sanft gegen das Augenlid, um den Augapfel zu stützen. Positionieren Sie die Pinzette hinter dem Augapfel und ziehen Sie. Übertragen Sie dann den Augapfel in den trockenen Bereich einer Petrischale, die ein kleines Volumen PBS mit Kalzium und Magnesium enthält, unter ein Präpariermikroskop und perforieren Sie mit einer Spitze der superfeinen Pinzette das Auge im Hornhautlimbus. Halten Sie dann den Augapfel mit einer feinen 45-Grad-Winkelzange fest und schneiden Sie mit einer Federschere um den Hornhautlimbus herum, bis etwa die Hälfte des Umfangs geschnitten ist.

Übertragen Sie den Augapfel in PBS und verwenden Sie eine zweite feine 45-Grad-Pinzette, um die Hornhaut und die Sklera auseinander zu reißen. Die Linse und die Netzhaut kommen intakt heraus. Stellen Sie sicher, dass die Linse und die Netzhaut getrennt sind, und übertragen Sie die Netzhaut in ein 5,4-Milliliter-Reagenzglas aus Polystyrol, das 2 Milliliter PBS mit Kalzium und Magnesium enthält.

Um eine einzellige Suspension der Netzhautzellen zu erhalten, verwenden Sie ein Dissoziationskit für neuronales Gewebe gemäß den Anweisungen des Herstellers und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern Färbepuffer. Übertragen Sie dann die Probe in eine Vertiefung einer 96-Well-U-Bodenplatte. Nach der Zentrifugation die Platte umdrehen, um den Überstand zu verwerfen, und die FC-Rezeptoren mit 25 Mikrolitern Färbepuffer mit CD16/CD32-Antikörpern pro Vertiefung für 5 Minuten bei Raumtemperatur blockieren. Markieren Sie anschließend die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit den interessierenden Antikörpern.

Pelletieren Sie dann die Zellen und waschen Sie anschließend 200 Mikroliter frischen Färbepuffer pro Vertiefung. Resuspendieren Sie nun die Pellets in 200 Mikrolitern Fleckenpuffer und Viabilitätsfarbstoff und überführen Sie die Proben in 1,2-Milliliter-Mikrotiterröhrchen. Waschen Sie dann die Vertiefungen mit zusätzlichen 100 Mikrolitern Färbepuffer und Viabilitätsfarbstoff und poolen Sie die Waschungen mit den entsprechenden Proben für die Analyse mittels Durchflusszytometrie.