JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 2:22 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer glasbasierten Bildgebungsschale, die eine Suspension menschlicher Neutrophilen – oder Immunzellen – enthält, und visualisieren Sie sie unter einem Fluoreszenzbildgebungssystem.
Führen Sie genetisch veränderte fluoreszierende Aspergillus-Reporterkonidien – oder Pilzsporen – ein und nehmen Sie Bilder in regelmäßigen Abständen von bis zu 6 Stunden auf.
Die Pilzsporen exprimieren rot fluoreszierende Proteine und sind extern mit nicht abbaubaren magentafarbenen Fluorophoren markiert – was hilft, tote Zellen von lebenden Zellen zu unterscheiden.
Während der Inkubation interagieren Neutrophile über Mustererkennungsrezeptoren mit pathogenassoziierten Molekülen auf Konidien und erleichtern so deren Einlagerung in ein Phagosom.
Später verschmilzt das Phagosom mit dem enzymhaltigen Lysosom zu einem Phagolysosom.
Im Inneren des Phagolysosoms bauen die reaktiven Sauerstoffspezies und Enzyme Konidien ab.
Während der Bildgebung von lebenden Zellen deutet eine intensive rote und magentafarbene Fluoreszenz im Phagosom von Neutrophilen zum ersten Zeitpunkt auf das Vorhandensein von lebenden Konidien hin.
Im Laufe der Zeit deutet eine Abnahme der roten Fluoreszenz unter Beibehaltung der magentafarbenen Fluoreszenz auf den Abbau von Konidien hin, was die antimykotische Aktivität von Neutrophilen bestätigt.
Um DsRed und AlexaFlour 633 während der Mikroskopie sichtbar zu machen, heizen Sie eine Mikroskopheizung vor und schalten Sie das Mikroskop und den Computer ein. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter 3 mal 10 zur 6. pro Milliliter FLARE-Konidiensuspension in die entsprechenden Vertiefungen der Bildgebungsschale hinzu. Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem FLARE-Konidien hinzugefügt werden.
Montieren Sie die Bildgebungsschüssel auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie dann in den Aufnahmeeinstellungen die Laserleistung auf 10 % und die Belichtungszeit auf eine Sekunde ein, passen Sie die Kameraempfindlichkeit für ein klares, aber nicht überbelichtetes Bild von DsRed und AF 633 an und richten Sie eine Liste von Tischpunkten ein. Initialisieren Sie die Bildgebung, wenn alle Punkte scharf sind, die Fluoreszenzkanäle optimiert und die Zykluszeit und -dauer eingestellt sind.