Ein Assay zur verzögerten Wachstumshemmung zur Bewertung der Wirkung von antimikrobiellen Verbindungen aus Bakterien
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 3:37 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer nährstoffhaltigen Agarplatte und geben Sie einen Tropfen einer Übernachtkultur mit inhibitorproduzierenden Primärbakterien in die Mitte.
Lassen Sie die Kultur trocknen, um eine minimale Ausbreitung von Bakterien zu gewährleisten, und inkubieren Sie.
Einzelne Bakterien bilden unterschiedliche Kolonien und sezernieren antimikrobielle Verbindungen – inhibitorische Moleküle, die bis zu einer bestimmten Entfernung durch den Agar diffundieren.
Sprühen Sie eine verdünnte Kultur eines konkurrierenden Bakterienstamms gleichmäßig auf die Agaroberfläche, die Kolonien von Primärbakterien enthält.
Während der Inkubation interagieren die antimikrobiellen Verbindungen mit den konkurrierenden Bakterien und stören deren essentielle zelluläre Prozesse.
Dies führt zum Absterben von Konkurrenzbakterien in diesem speziellen Bereich, was zu einem deutlichen Rückgang des Bakterienwachstums führt.
Im Bereich ohne antimikrobielle Wirkstoffe verwerten konkurrierende Bakterien die Nährstoffe und bilden ausgeprägte Kolonien.
Dadurch entsteht ein differentielles Wachstumsmuster mit einer ausgeprägten Hemmzone. Bestimmen Sie den Durchmesser dieser Zone und die Klarheit der Zone, um die Wirkung von antimikrobiellen Verbindungen aus Bakterien zu bewerten.
Um bakterielle Übernachtkulturen herzustellen, streichen Sie die Konkurrenz- und Inhibitorstämme auf eine sterile BHI-Agarplatte und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius aerob für etwa 18 Stunden. Beimpfen Sie in einer 28-Milliliter-Universalflasche 10 Milliliter sterile BHI-Bouillon mit einer einzigen Kolonie des gewünschten Konkurrenzbakterienstamms.
Inkubieren Sie die Kultur über Nacht in einem universellen Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 250 U/min. Stellen Sie am nächsten Tag sicher, dass die Agarplatten vollständig trocken sind und sich kein Kondenswasser auf dem Deckel bildet, um zu verhindern, dass sich die Impfung auf der Platte ausbreitet. Pipettieren Sie 25 Mikroliter der Übernachtkultur in die Mitte der Agarplatten, wobei Sie den Pipettenkolben nicht vollständig durchdrücken, um Luftblasen zu vermeiden, die die Kultur über den Agar sprühen.
Lassen Sie die Kultur bei Raumtemperatur trocknen, um die Ausbreitung der Kultur zu begrenzen. Inkubieren Sie die Agarplatten dann aerob bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nachdem Sie eine Kultur über Nacht gezüchtet haben, während Sie unter einem Sicherheitsschrank der Stufe 2 gearbeitet haben, der mit saugfähigem Papier ausgelegt ist, verwenden Sie BHI-Brühe, um die Kultur zu verzehnfachen, um etwa 4 mal 10 bis sechste KBE pro Milliliter zu erhalten. Gießen Sie dann die verdünnte Kultur in eine sterile Plastikflasche für einen Parfümverdampfer.
Um einen Assay zur verzögerten Wachstumshemmung durchzuführen, sprühen Sie die Kultur durch jede der Verdampferflaschen, um sicherzustellen, dass die Kultur in den Sprühmechanismus geladen wird, bevor sie auf den Agar gesprüht wird. Aus einem Abstand von etwa 15 Zentimetern über dem Agar werden ca. 250 Mikroliter verdünnte Kultur über die gesamte Agaroberfläche gesprüht. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius aerob über Nacht.
Um die verzögerte Wachstumshemmung zu interpretieren, messen Sie die Wachstumshemmungszone des besprühten Konkurrenzstamms in Millimetern und subtrahieren Sie den Durchmesser des zentralen Spots des Inhibitorherstellers. Notieren Sie abschließend den Klarheitswert für Hemmzonen gemäß dem Textprotokoll.
Übersicht
Diese Studie untersucht die antimikrobiellen Wirkungen von Inhibitoren produzierenden Primärbakterien auf konkurrierende Bakterienstämme mithilfe eines verzögerten Wachstumshemmungstests. Durch die Messung der Hemmzonen können Forscher die Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen beurteilen, die von den Primärbakterien sezerniert werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Antimikrobielle Forschung
- Hemmungsassays
Hintergrund
- Bakterien, die Inhibitoren produzieren, können antimikrobielle Verbindungen absondern.
- Diese Verbindungen können das Wachstum konkurrierender Bakterienstämme hemmen.
- Das Verständnis dieser Wechselwirkungen kann die Entwicklung von Antibiotika unterstützen.
- Assays zur verzögerten Wachstumshemmung sind eine Standardmethode, um antimikrobielle Aktivität zu bewerten.
Zweck der Studie
- Um die antimikrobiellen Wirkungen von Primärbakterien auf konkurrierende Stämme zu bewerten.
- Um die von antimikrobiellen Verbindungen erzeugten Hemmzonen zu messen.
- Um die Klarheit und den Durchmesser der Hemmzonen als Indikatoren für die Wirksamkeit zu beurteilen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Agarplatten mit primären Bakterienkulturen.
- Auftragung konkurrierender Bakterienstämme auf die Agaroberfläche.
- Bebrütung der Platten, um Wachstum und Wechselwirkungen zu ermöglichen.
- Messung der Hemmzonen zur Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit.
Hauptergebnisse
- Um die Kolonien der Primärbakterien waren deutliche Hemmzonen zu beobachten.
- Konkurrierende Bakterien zeigten ein vermindertes Wachstum in Bereichen mit antimikrobiellen Verbindungen.
- Der Durchmesser der Hemmzonen variierte je nach verwendeten Primärbakterien.
- Klarheitswerte zeigten die Wirksamkeit der antimikrobiellen Verbindungen an.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstrierte erfolgreich die antimikrobiellen Eigenschaften der primären Bakterien.
- Verzögerte Wachstumshemmtests eignen sich zur Bewertung bakterieller Interaktionen.
- Die Ergebnisse können zum Verständnis bakterieller Konkurrenz und der Antibiotikaentwicklung beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Der verzögerte Wachstumshemmtest bietet eine robuste Plattform zur Quantifizierung der Wirkung bakteriell abgeleiteter antimikrobieller Verbindungen auf konkurrierende Stämme und unterstützt die frühe Entdeckung antimikrobieller Substanzen. Durch die präzise Messung von Hemmzonen und deren Klarheit liefert dieser Test Hinweise zur Zielvalidierung und zur mechanistischen Risikominderung in antimikrobiellen Forschungs- und Entwicklungsprozessen. Seine reproduzierbaren Ergebnisse erleichtern die Portfolioauswahl und die Priorisierung von Kandidatenverbindungen für die weitere Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen gegen konkurrierende Bakterien.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Inhibitoren produzierenden Stämmen als Quelle neuartiger Antimikrobiotika.
- Liefert quantitative Daten zur mechanistischen Entschärfung von Risiken und zur Zielhypothesensicherheit.
- Unterstützt frühzeitige Go/No-Go-Entscheidungen bei der Identifizierung antimikrobieller Leitsubstanzen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Legt einen standardisierten, reproduzierbaren Assay zur Bewertung der antimikrobiellen Aktivität fest.
- Ermöglicht quantitative Messungen der Hemmzonen für den vergleichenden Screening.
- Ermöglicht Skalierbarkeit und Wiederverwendung der Plattform über verschiedene Bakterienstämme hinweg.
- Ermöglicht eine zuverlässige Beurteilung der Verbindungspotenz für nachgeschaltete Arbeitsabläufe.
Translationale und präklinische Forschung
- Ergänzt translationale Biomarker-Strategien, indem funktionelle antimikrobielle Wirkungen quantifiziert werden.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung antimikrobieller Kandidaten.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf reproduzierbaren biologischen Ergebnissen.
- Bietet prädiktive Entschärfung von Risiken bei der Kandidatenauswahl in antimikrobiellen Portfolios.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser Test integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase und verbindet die frühe Zielvalidierung, die Identifizierung von Leitsubstanzen und die präklinische Bewertung antimikrobieller Verbindungen.
- Entdeckungsbiochemie: Quantifiziert antimikrobielle Aktivität, um biologische Wirkmechanismen aufzuklären und Zielstrukturen zu validieren.
- Screening: Liefert standardisierte, reproduzierbare Daten zur Hemmzone für den Vergleich von Verbindungen.
- Analytik: Bietet messbare Ergebnisgrößen – Durchmesser und Klarheit der Hemmzone – für eine robuste statistische Analyse.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Kontinuität, indem sie die Wirksamkeit in vitro mit der präklinischen Kandidatenauswahl verknüpft.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Testplattform, die an verschiedene bakterielle Systeme angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Entdeckung von Antimikrobiellen Wirkstoffen.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Assays über verschiedene Forschungs- und Entwicklungsteams hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Fortführung oder Einstellung von Projekten und die Kapitalnutzungseffizienz in frühen Entwicklungsphasen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von antimikrobiellen Kandidaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrobiologischer Kultivierung und quantitativer Auswertung von Assays.
- Benötigt Zugang zu sterilen Agarplatten, Inkubatoren und präzisen Messgeräten.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, um reproduzierbare Zonenmessungen und eine klare Bewertung der Helligkeit zu gewährleisten.
- Kann auf verschiedene Bakterienstämme angewendet werden, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung des Protokolls für unterschiedliche Arten.
- Hängt von genauen Verdünnungs- und Ausplattierungstechniken ab, um die Zuverlässigkeit des Assays sicherzustellen.
Biopharma-Häufige Fragen
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026