Ein Assay zur verzögerten Wachstumshemmung zur Bewertung der Wirkung von antimikrobiellen Verbindungen aus Bakterien

Beginnen Sie mit einer nährstoffhaltigen Agarplatte und geben Sie einen Tropfen einer Übernachtkultur mit inhibitorproduzierenden Primärbakterien in die Mitte.

Lassen Sie die Kultur trocknen, um eine minimale Ausbreitung von Bakterien zu gewährleisten, und inkubieren Sie.

Einzelne Bakterien bilden unterschiedliche Kolonien und sezernieren antimikrobielle Verbindungen – inhibitorische Moleküle, die bis zu einer bestimmten Entfernung durch den Agar diffundieren.

Sprühen Sie eine verdünnte Kultur eines konkurrierenden Bakterienstamms gleichmäßig auf die Agaroberfläche, die Kolonien von Primärbakterien enthält.

Während der Inkubation interagieren die antimikrobiellen Verbindungen mit den konkurrierenden Bakterien und stören deren essentielle zelluläre Prozesse.

Dies führt zum Absterben von Konkurrenzbakterien in diesem speziellen Bereich, was zu einem deutlichen Rückgang des Bakterienwachstums führt.

Im Bereich ohne antimikrobielle Wirkstoffe verwerten konkurrierende Bakterien die Nährstoffe und bilden ausgeprägte Kolonien.

Dadurch entsteht ein differentielles Wachstumsmuster mit einer ausgeprägten Hemmzone. Bestimmen Sie den Durchmesser dieser Zone und die Klarheit der Zone, um die Wirkung von antimikrobiellen Verbindungen aus Bakterien zu bewerten.

Um bakterielle Übernachtkulturen herzustellen, streichen Sie die Konkurrenz- und Inhibitorstämme auf eine sterile BHI-Agarplatte und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius aerob für etwa 18 Stunden. Beimpfen Sie in einer 28-Milliliter-Universalflasche 10 Milliliter sterile BHI-Bouillon mit einer einzigen Kolonie des gewünschten Konkurrenzbakterienstamms.

Inkubieren Sie die Kultur über Nacht in einem universellen Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 250 U/min. Stellen Sie am nächsten Tag sicher, dass die Agarplatten vollständig trocken sind und sich kein Kondenswasser auf dem Deckel bildet, um zu verhindern, dass sich die Impfung auf der Platte ausbreitet. Pipettieren Sie 25 Mikroliter der Übernachtkultur in die Mitte der Agarplatten, wobei Sie den Pipettenkolben nicht vollständig durchdrücken, um Luftblasen zu vermeiden, die die Kultur über den Agar sprühen.

Lassen Sie die Kultur bei Raumtemperatur trocknen, um die Ausbreitung der Kultur zu begrenzen. Inkubieren Sie die Agarplatten dann aerob bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nachdem Sie eine Kultur über Nacht gezüchtet haben, während Sie unter einem Sicherheitsschrank der Stufe 2 gearbeitet haben, der mit saugfähigem Papier ausgelegt ist, verwenden Sie BHI-Brühe, um die Kultur zu verzehnfachen, um etwa 4 mal 10 bis sechste KBE pro Milliliter zu erhalten. Gießen Sie dann die verdünnte Kultur in eine sterile Plastikflasche für einen Parfümverdampfer.

Um einen Assay zur verzögerten Wachstumshemmung durchzuführen, sprühen Sie die Kultur durch jede der Verdampferflaschen, um sicherzustellen, dass die Kultur in den Sprühmechanismus geladen wird, bevor sie auf den Agar gesprüht wird. Aus einem Abstand von etwa 15 Zentimetern über dem Agar werden ca. 250 Mikroliter verdünnte Kultur über die gesamte Agaroberfläche gesprüht. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius aerob über Nacht.

Um die verzögerte Wachstumshemmung zu interpretieren, messen Sie die Wachstumshemmungszone des besprühten Konkurrenzstamms in Millimetern und subtrahieren Sie den Durchmesser des zentralen Spots des Inhibitorherstellers. Notieren Sie abschließend den Klarheitswert für Hemmzonen gemäß dem Textprotokoll.