Ein zellulärer Assay zur Identifizierung von CXCR4-interagierenden Wirkstoffen

Nehmen Sie eine mit Gelatine beschichtete Multiwell-Platte, die anhaftende menschliche Hirntumorzellen enthält, die CXCR4 exprimieren.

Ersetzen Sie das Medium durch einen kalziumempfindlichen Farbstoff. Intrazelluläre Esterasen spalten den Farbstoff in ein membranundurchlässiges Produkt, das an Kalziumionen bindet und eine erhöhte Fluoreszenz aufweist.

Entfernen Sie den Farbstoff, waschen Sie ihn und fügen Sie Puffer hinzu.

Legen Sie die Platte in einen Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader mit CXCR4-interagierender Verbindung und Chemokin CXCL12-haltigen Platten.

Unter Verwendung festgelegter automatisierter Parameter werden steigende Verbindungskonzentrationen in die Testvertiefungen injiziert, gefolgt von einer spezifischen CXCL12-Konzentration.

In Kontrollvertiefungen ohne die Verbindung bindet CXCL12 an CXCR4.

Diese Bindung aktiviert eine Signalkaskade, die Kalziumionen in das Zytoplasma freisetzt, wo sie den Farbstoff binden und die Fluoreszenz verstärken.

In Testvertiefungen hemmen wechselwirkende Verbindungen jedoch die Bindung von CXCL12 an CXCR4, was die Kalziummobilisierung beeinflusst und eine dosisabhängige Fluoreszenzabnahme verursacht, was sie als CXCR4-Antagonisten bestätigt.

Beschichten Sie am Tag der Zellpassage jede Vertiefung einer schwarz wandigen Polystyrol-96-Well-Platte mit durchsichtigem Boden mit 100 Mikrolitern 0,1%iger Gelatinelösung und inkubieren Sie die Platten zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Während die Gelatine erstarrt, verwenden Sie eine Trypsin-EDTA-Lösung, um die interessierenden Zellen vom Boden ihres Kulturkolbens zu heben, und resuspendieren Sie die Zellen in frischem Wachstumsmedium in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen, sobald sie sich gelöst haben.

Nach der Zählung werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in frischem Wachstumsmedium auf eine Konzentration von 1 x 10⁵ lebensfähigen Zellen pro Milliliter resuspendiert. Wenn die Platten fertig sind, entsorgen Sie überschüssige Gelatinelösung und trocknen Sie die Platten auf einem Laborgewebe. Waschen Sie dann die Vertiefungen mit 200 Mikrolitern PBS und ersetzen Sie die Wäsche durch 200 Mikroliter Zellen pro Vertiefung, für eine Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Klopfen Sie am nächsten Morgen auf die Platte, um das Wachstumsmedium aus den Vertiefungen zu entfernen, und trocknen Sie die Platte kopfüber auf einem Papiertuch. Markieren Sie dann die Zellen in jeder Vertiefung mit 100 Mikrolitern Ladefarbstofflösung pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 45 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Während die Zellen inkubieren, fügen Sie 75 Mikroliter CXCL12 pro Vertiefung in die Chemokinplatte und 50 Mikroliter der interessierenden Verbindung in jede Vertiefung der Verbundplatte hinzu.

Schalten Sie als Nächstes die Kühleinheit des Fluoreszenzplatten-Readers ein, gefolgt vom Platten-Reader selbst. Nachdem Sie das System einige Minuten lang gestartet haben, öffnen Sie die Plattenlesersoftware. Um das Assay-Protokoll einzurichten, wählen Sie auf der Registerkarte "Einstellungen" die Option "Lesemodus" und die entsprechende Anregungs- und Emissionswellenlänge für den Ladefarbstoff aus.

Wählen Sie die Registerkarte "Mit Transferflüssigkeit mischen", um die Verbindungen in der Mischplatte automatisch zu mischen. Legen Sie auf der Registerkarte "Transfer Fluid" 20 Mikroliter jeder Vertiefung aus der Verbundplatte ein, die in die Messplatte übertragen werden soll, und positionieren Sie die Pipettenspitzen 20 Mikroliter unter der Flüssigkeitsoberfläche. Stellen Sie die Aspirationsgeschwindigkeit auf 50 Mikroliter pro Sekunde und die Dosiergeschwindigkeit auf 25 Mikroliter pro Sekunde ein und klicken Sie auf "Mit Transferflüssigkeit lesen".

Während des ersten Intervalls werden 60 Reads mit einer Leseintervallzeit von einer Sekunde ausgewählt, wobei 10 Reads aufgezeichnet werden, bevor die Verbindungen in die Messplatte abgegeben werden, und 50 Reads, die danach abgeschlossen werden. Stellen Sie das zweite Intervall mit der Leseintervallzeit von 30 Sekunden und 18 Lesevorgängen ein. Wählen Sie drei Spitzenwaschgänge für das Protokoll aus und stellen Sie jeden Waschschritt so ein, dass er die passende Waschflüssigkeit, einen Waschgang, eine schnelle Pumpendrehzahl und fünf Hübe pro Waschgang umfasst.

Verwenden Sie die Funktion "Pipettor pausieren", um eine Pipettierpause von 300 Sekunden einzuplanen, und verwenden Sie die Einstellung "Mit Transferflüssigkeit mischen", um das automatische Mischen der CXCL12-Lösung in der Chemokinplatte zu ermöglichen. Im anschließenden Reiter "Transfer Fluid" setzen Sie aus jeder Vertiefung der Chemokinplatte, die auf die Messplatte übertragen werden soll, 25 Mikroliter ein und positionieren Sie die Spitzen 20 Mikroliter unter der Flüssigkeitsoberfläche. Stellen Sie die Aspirationsgeschwindigkeit auf 50 Mikroliter pro Sekunde und die Abgabegeschwindigkeit auf 25 Mikroliter pro Sekunde ein.

Verwenden Sie die Schaltfläche "Mit Flüssigkeit übertragen", um das erste Intervall so einzustellen, dass es 145 Lesevorgänge mit einer Leseintervallzeit von einer Sekunde umfasst. Legen Sie das zweite Intervall auf eine Leseintervallzeit von sechs Sekunden und 20 Lesevorgängen fest. Wählen Sie drei weitere Waschgänge aus, klicken Sie dann auf "Tischtemperatur einstellen" und stellen Sie die Gerätetemperatur auf 37 Grad Celsius ein.

Entsorgen Sie am Ende der Inkubation des Ladefarbstoffs den Puffer von der Messplatte und trocknen Sie die Platte auf einem Laborgewebe. Waschen Sie die Zellen mit 150 Mikrolitern Assay-Puffer pro Vertiefung und ersetzen Sie den Puffer nach zwei Minuten durch 80 Mikroliter Assay-Puffer. Platzieren Sie die Messplatte in der Leseposition, die Verbundplatte in der Position von Quelle 2, die Chemokinplatte an der Position von Quelle 3 und eine Schachtel mit schwarzen Spitzen an der Position von Quelle 1.

Schließen Sie das Gerät und klicken Sie auf "Protocol Signal Test", um die relativen Hintergrundlichteinheiten und Fluoreszenzvarianten über der Platte zu bestimmen. Wählen Sie im Pop-up-Fenster "Signal testen". Wenn Hintergrundwerte von 8.000 bis 10.000 relativen Lichteinheiten erhalten werden, wählen Sie "Aktualisieren" und klicken Sie auf "Speichern", um das Hauptprotokoll zu speichern.