Ein zellulärer Assay zur Identifizierung von CXCR4-interagierenden Wirkstoffen

Nehmen Sie eine mit Gelatine beschichtete Multiwell-Platte, die anhaftende menschliche Hirntumorzellen enthält, die CXCR4 exprimieren.

Ersetzen Sie das Medium durch einen kalziumempfindlichen Farbstoff. Intrazelluläre Esterasen spalten den Farbstoff in ein membranundurchlässiges Produkt, das an Kalziumionen bindet und eine erhöhte Fluoreszenz aufweist.

Entfernen Sie den Farbstoff, waschen Sie ihn und fügen Sie Puffer hinzu.

Legen Sie die Platte in einen Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader mit CXCR4-interagierender Verbindung und Chemokin CXCL12-haltigen Platten.

Unter Verwendung festgelegter automatisierter Parameter werden steigende Verbindungskonzentrationen in die Testvertiefungen injiziert, gefolgt von einer spezifischen CXCL12-Konzentration.

In Kontrollvertiefungen ohne die Verbindung bindet CXCL12 an CXCR4.

Diese Bindung aktiviert eine Signalkaskade, die Kalziumionen in das Zytoplasma freisetzt, wo sie den Farbstoff binden und die Fluoreszenz verstärken.

In Testvertiefungen hemmen wechselwirkende Verbindungen jedoch die Bindung von CXCL12 an CXCR4, was die Kalziummobilisierung beeinflusst und eine dosisabhängige Fluoreszenzabnahme verursacht, was sie als CXCR4-Antagonisten bestät