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Immunologie
0 Aufrufe • 3:20 Min. • July 8th, 2025
α-Galactosidase A und saure α-Glucosidase sind lysosomale Enzyme, die für den Zellstoffwechsel entscheidend sind.
α-Galactosidase A baut Substrate wie Glykolipide ab, während saure α-Glucosidase Glykogen hydrolysiert.
Um ihre Enzymaktivität in vitro zu messen, nehmen Sie Multi-Well-Plattenvertiefungen mit Proben, die bekannte Konzentrationen von α-Galactosidase A bzw. Säure α-Glucosidase enthalten.
Geben Sie das erforderliche Volumen an sauren Lösungen von synthetischen 4-Methylumbelliferyl-Substraten in die Vertiefungen, spezifische fluorogene Substrate, die so konzipiert sind, dass sie natürliche Substrate für diese Enzyme nachahmen.
Im Dunkeln inkubieren.
α-Galactosidase A und saure α-Glucosidase-Enzyme spalten ihre jeweiligen Substrate und setzen das Fluoreszenzprodukt 4-Methylumbelliferon frei.
Fügen Sie einen alkalischen Puffer hinzu, um die enzymatische Reaktion zu beenden.
Messen Sie mit einem Mikroplatten-Fluoreszenz-Reader die Fluoreszenzintensität des 4-Methylumbelliferons in den Vertiefungen, die auf seine Konzentration hinweist, um die Aktivität des α-Galactosidase A bzw. des sauren α-Glucosidase-Enzyms zu bestimmen.
Verdünnen Sie die berechnete Menge jeder Probe und pipettieren Sie sie in frische 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen, um 0,05 Mikrogramm Alpha-Galactosidase A oder 0,5 Mikrogramm saure Alpha-Glucosidase pro Mikroliter Lösung zu erhalten. Wirbeln Sie die Proben erneut 5 Sekunden lang vor, pipettieren Sie 10 Mikroliter dieser Verdünnung und duplizieren Sie sie in eine 96-Well-Platte.
Starten Sie die Reaktionen durch Zugabe von 20 Mikrolitern der jeweiligen Substratlösung. Für Alpha-Galactosidase A fügen Sie 2 Millimolare 4-Methylumbelliferyl-alpha-D-galactopyranosid oder 4-MU-Gal in 0,06 molare Phosphatcitratpuffer mit einem pH-Wert von 4,7 hinzu. Für saure Alpha-Glucosidase fügen Sie 2 Millimolare 4-Methylumbelliferyl-alpha-D-Glucopyranosid oder 4-MU-Glu in 0,025 molaren Natriumacetat, pH 4,0, hinzu.
Inkubieren Sie die Enzymreaktionen 1 Stunde lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius und 300 U/min auf einem Orbitalschüttler. Beenden Sie dann die Reaktion, indem Sie 200 Mikroliter 1,0 molaren pH 10,5 angepassten Glycin-Natriumhydroxid-Puffer hinzufügen. Bereiten Sie eine Standardkurve von 4-MU aus einem Stamm von 0,01 Milligramm pro Milliliter gemäß dem Textprotokoll vor und pipettieren Sie 10 Mikroliter der Lösungen in doppelter Ausführung in eine 96-Well-Platte.
Geben Sie 200 Mikroliter des 1,0 molaren Glycin-Natriumhydroxid-Puffers in jede Vertiefung, um das Volumen und den pH-Wert einzustellen. Messen Sie abschließend die Enzymaktivität in einem Fluoreszenz-Reader, der mit dem entsprechenden Filtersatz ausgestattet ist, und analysieren Sie die Daten mit der entsprechenden Software für das Fluoreszenz-Reader-Gerät.