Ein Assay zur Bewertung der Wirkung von Testverbindungen auf den Eintritt und die Fusion von Viren in Wirtszellen

Nehmen Sie Leberkrebszellen und inkubieren Sie sie bei niedriger Temperatur, um die Endozytose zu beeinträchtigen.

Einführung eines rekombinanten Hepatitis-C-Virus oder HCV, das aus einem manipulierten RNA-Genom besteht, das für einen sezernierten Luciferase-Reporter kodiert.

Die viralen Lipoproteine interagieren mit den Proteoglykanen auf den Wirtszellen, während die viralen Hüllglykoproteine an spezifische Wirtsrezeptoren binden.

Fügen Sie in ausgewählten Vertiefungen die Testverbindung hinzu, die an virale Glykoproteine bindet.

Nach der Inkubation bei physiologischer Temperatur werden die gebundenen Viren endozytiert.

Verwerfen Sie die nicht internalisierten Viren, fügen Sie ein Wachstumsmedium hinzu und inkubieren Sie.

In den unbehandelten Vertiefungen unterstützen die Glykoproteine die virale Hüllkurven-Endosomen-Fusion und setzen das Nukleokapsid frei, während die Maskierung der Verbindung die Fusion in den behandelten Vertiefungen beeinträchtigt.

Bei der Freisetzung exprimiert die RNA virale Proteine, einschließlich Luciferase, die extrazellulär sezerniert wird.

Ernten Sie den luciferasehaltigen Überstand und fügen Sie ein biolumineszierendes Substrat hinzu, das durch Luciferase oxidiert wird, um Licht zu emittieren.

Eine verminderte Lumineszenz in den behandelten Vertiefungen im Vergleich zu den unbehandelten deutet auf eine Hemmung der viralen Hüllkurven-Endosomen-Fusion hin.

Um die virale Fusion und den Eintritt zu testen, kühlen Sie die Zellkulturplatte nach der Inkubation über Nacht eine Stunde lang bei 4 Grad Celsius vor, um die Zellanheftung zu ermöglichen. Entfernen Sie das vorhandene Medium aus den Vertiefungen und infizieren Sie die Zellen mit 10 bis zum zweiten FFU HCV auf Eis.

Inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 200 Mikrolitern eiskaltem PBS, um das nicht anhaftende Virus zu entfernen. Behandeln Sie dann die Zellen auf Eis mit einer Testverbindung, die in Basalmedium oder Basalmedium mit 1 % DMSO als Kontrolle gelöst ist, und inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Dies ermöglicht die Beurteilung der Testverbindungen beim Viruseintritt, der bei 37 Grad Celsius erfolgt.

Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die nicht internalisierten Viren zweimal mit 200 Mikrolitern Citratpuffer oder PBS. Fügen Sie 100 Mikroliter Basalmedium pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie weitere 72 Stunden bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und führen Sie den Gaussia-Luziferase-Assay wie zuvor gezeigt zum Nachweis des freigesetzten Luciferase-Reporters durch.