Kolorimetrischer Nachweis eines bakteriellen Biomarkers mittels eines modifizierten Lackmustests

Beginnen Sie mit einem RNA-spaltenden DNAzym, einer katalytischen DNA, die bei der Bindung an einen bestimmten bakteriellen Biomarker aktiviert wird.

Das DNAzym ist über Biotin an seinem 5'-Ende mit einer Streptavidin-beschichteten magnetischen Kugel verbunden. Am 3'-Ende ist es an eine Oligonukleotid-gebundene Urease gebunden und bildet eine funktionelle magnetische Kugel.

In ein Röhrchen mit funktionellen magnetischen Kügelchen geben Sie ein E. coli-Lysat.

Ein spezifischer E. coli-Biomarker aus dem Lysat aktiviert das DNAzym, wodurch die Spaltung der RNA-Bindung ausgelöst wird, was zur Ablösung des DNAzym-Urease-Konjugats führt.

Verwenden Sie einen magnetischen Ständer, um die Kügelchen zu immobilisieren und das perlengebundene DNAzyme-Urease-Konjugat zu entfernen.

Übertragen Sie den freigesetzten ureasehaltigen Überstand in ein anderes Röhrchen.

Fügen Sie einen pH-Indikatorfarbstoff – Phenolrot – und eine Harnstofflösung hinzu.

Die Urease hydrolysiert Harnstoff zu Ammoniak und Kohlendioxid.

Ammoniak, eine schwache Base, erhöht den pH-Wert der Lösung, was zu einer Farbveränderung führt, die auf das Vorhandensein des E. coli-Biomarkers hinweist.

Nach der Aufbereitung der E. coli-Zellen gemäß dem Textprotokoll wird ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen vorgewaschen, indem 100 Mikroliter RB hinzugefügt und vortexiert werden. Verwerfen Sie dann den Puffer.

Geben Sie 15 Mikroliter zusammengesetztes EC1 in das gewaschene Röhrchen, legen Sie das Röhrchen auf das Magnetgestell und saugen Sie den Überstand an. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Gestell, fügen Sie 100 Mikroliter RB hinzu und resuspendieren Sie die magnetischen Kügelchen vorsichtig.

Nachdem Sie die Kügelchen mit RB noch zwei Mal gewaschen und den RB entfernt haben, geben Sie 10 Mikroliter der E. coli-Probe in das Röhrchen und mischen Sie den Inhalt vorsichtig, indem Sie auf das Röhrchen klopfen. Inkubieren Sie die Reaktion dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Fügen Sie nach der Inkubation 90 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzu und stellen Sie das Röhrchen auf das Magnetgestell. Nach etwa drei Minuten magnetischer Trennung werden vorsichtig 85 Mikroliter des Überstands in ein 0,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen überführt.

Es ist sehr wichtig, die Lösung vorsichtig zu pipettieren, ohne die magnetischen Kügelchen aufzunehmen. Diese Kügelchen sind mit Urease beladen und erzeugen ein falsch positives Signal.

15 Mikroliter 0,04 % Phenolrot und 100 Mikroliter Substratlösung hinzufügen. Nehmen Sie dann in bestimmten Zeitintervallen Fotos auf, um eine Farbänderung aufzuzeichnen.