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Immunologie
0 Aufrufe • 4:07 Min. • July 8th, 2025
Nehmen wir Transfektionskomplexe, die Reporter-mRNAs umfassen, die für Glühwürmchen-Luziferase (Fluc) und Renilla-Luziferase (Rluc) kodieren.
Die Fluc-mRNA enthält eine 5'-Polyadenosin-Sequenz oder einen Poly(A)-Leader, während der Rluc-mRNA diese Sequenz fehlt.
Transfizieren Sie nicht infizierte und mit Pockenviren infizierte Säugetierzellen, um die Reporter-mRNAs zu liefern, und inkubieren Sie.
In nicht infizierten Zellen binden eukaryotische Initiationsfaktoren an die 5'-Kappe der mRNA, gefolgt von der Rekrutierung der kleinen ribosomalen Untereinheit und einer Initiator-tRNA.
Auf der kleinen Untereinheit, in der sich das Startcodon befindet, verbindet sich die große Untereinheit, um Luciferase-Proteine zu synthetisieren.
In infizierten Zellen bewirkt die Pockenvirus-vermittelte Phosphorylierung der kleinen Untereinheit eine Ribosomenassemblierung direkt an der Leader-Sequenz, wodurch die Fluc-Produktion erhöht wird.
Lysieren Sie die Zellen, um die Luciferasen freizusetzen.
Fügen Sie das Fluc-Substrat hinzu, das das Enzym oxidiert und Licht emittiert. Messen Sie mit einem Plattenlesegerät die Lumineszenz.
Wiederholen Sie den Schritt für Rluc, um die relative Zunahme der Fluc-Lum
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