Eine Mikrotiterplattenmethode zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration eines Antibiotikums

Nehmen Sie Mikrotiterplatten ein, die ein seriell verdünntes Aminoglykosid-Antibiotikum enthalten. Eine der Platten enthält NTBC, eine synthetische Droge.

Pseudomonas aeruginosa, ein gramnegatives Bakterium, einführen und inkubieren.

Die Bakterien produzieren Pyomelanin - ein schützendes extrazelluläres Pigment - in den NTBC-unbehandelten Vertiefungen, während das Medikament die Produktion von Pyomelanin verhindert.

Das kationische Antibiotikum bindet an anionische Lipopolysaccharide (LPS) auf der bakteriellen Außenmembran, verdrängt die kationischen Brücken und destabilisiert die Membran.

Beim Eintritt in die Bakterien bindet das Antibiotikum an die Aminoacylstelle oder A-Stelle in der ribosomalen 30S-Untereinheit.

Das gebundene Antibiotikum verhindert die Bindung an Aminoacyl-tRNA und die ribosomale Bewegung über die mRNA, stört die Proteinsynthese und hemmt das Bakterienwachstum.

Messen Sie nach der Inkubation die optische Dichte der Kultur, um das Bakterienwachstum zu beurteilen.

Die niedrigste Antibiotikakonzentration, die das Bakterienwachstum verhindert, ist die minimale Hemmkonzentration oder MHK.

Ähnliche MHK-Werte für NTBC-behandelte und NTBC-unbehandelte Vertiefungen deuten darauf hin, dass NTBC keinen Einfluss auf die Antibiotikaempfindlichkeit von Bakterien hat.

Bereiten Sie einen Tag vor dem MHK-Assay Kulturen der Stämme vor, die in LB mit und ohne 2-[2-Nitro-4-trifluormethyl)benzoyl]-1-3-cyclohexandion oder NTBC getestet werden sollen. Diese Demonstration verwendet das repräsentative Niveau von 300 Mikromolaren von NTBC. Das Titrationsverfahren zur Bestimmung der geeigneten Konzentration von NTBC ist im Protokolltext beschrieben. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Belüftung. Stellen Sie am nächsten Tag LB plus NTBC und LB plus DMSO Master-Lösungen für den MIC-Assay her.

Um ein Antibiotikum auf einen Stamm zu testen, fügen Sie 600 Mikromolar NTBC zu 2 Millilitern LB hinzu und mischen Sie, um die NTBC-Masterlösung herzustellen. NTBC wird in einer Konzentration von 600 Mikromolaren zugegeben, da es bei Zugabe des Inokulums doppelt verdünnt wird, was eine Endkonzentration von 300 Mikromolaren ergibt. Fügen Sie ein äquivalentes Volumen des Fahrzeug-DMSO zu 2 Millilitern LB hinzu und mischen Sie, um die NTBC-freie Masterlösung herzustellen. Diese beiden Master-Lösungen werden sowohl für die Herstellung von Antibiotika-Stammlösungen als auch für den Aufbau der Verdünnungsreihe in 96-Well-Platten verwendet.

Bereiten Sie als Nächstes die Antibiotikalösungen in den Masterlösungen LB plus NTBC oder LB plus DMSO vor. Bereiten Sie das Gentamicin plus oder minus NTBC-Stammlösung bei 64 Mikrogramm pro Milliliter vor. Stellen Sie das Kanamycin plus oder minus NTBC-Stammlösung bei 256 Mikrogramm pro Milliliter her. Bereiten Sie das Tobramycin plus oder minus NTBC-Stammlösung mit 8 Mikrogramm pro Milliliter vor.

Nachdem die 2X-Antibiotikalösungen hergestellt wurden, geben Sie 100 Mikroliter jeder Antibiotikalösung in vier Vertiefungen in einer 96-Well-Platte in Reihe A. Zum Beispiel sollte Gentamicin in A1 bis A4 platziert werden. Kanamycin sollte in A5 bis A8 und Tobramycin in A9 bis A12 eingeteilt werden.

Geben Sie 50 Mikroliter LB plus NTBC oder LB plus DMSO-Masterlösung in die Reihen B bis H der 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass eine Platte LB plus NTBC und eine Platte LB plus DMSO ist. Führen Sie mit einem Mikropipettenkopf eine zweifache serielle Verdünnung der Antibiotika durch, indem Sie 50 Mikroliter der Lösung von Reihe A in Reihe B übertragen. Mischen Sie die Lösung, wechseln Sie die Pipettenspitzen und übertragen Sie 50 Mikroliter der Lösung von Reihe B nach Reihe C. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Reihen.

Nach dem Verdünnen von Reihe G 50 Mikroliter der Lösung aus dieser Reihe entfernen und verwerfen. Verwenden Sie Reihe H als antibiotische Kontrolle gegen das Bakterienwachstum. Holen Sie sich die Übernachtkulturen. Nachdem Sie alle Kulturen gewaschen haben, um das in den Medien vorhandene Biomelanin zu eliminieren, messen Sie den OD₆₀₀ der Kulturen. Verdünnen Sie die Übernachtkulturen in LB.

Geben Sie mit einer Mehrkanal-Mikropipette 50 Mikroliter der verdünnten Bakterienkultur in die entsprechenden Vertiefungen. Geben Sie Bakterien für jeden Stamm und jede Antibiotikakonzentration in drei Vertiefungen. Geben Sie 50 Mikroliter LB in die vierte Vertiefung, um die bakterielle Kontamination zu kontrollieren. Decken Sie die 96-Well-Platten mit Parafilm ab und inkubieren Sie sie etwa 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Untersuchen Sie am nächsten Tag die Platten visuell auf Bakterienwachstum in den Vertiefungen. Die MIC ist die niedrigste Konzentration von Antibiotika, bei der bei allen drei Replikaten jedes Stammes kein Bakterienwachstum zu beobachten ist.