Quantitative Zeitraffermikroskopie zur Beurteilung der Steifigkeitsabhängigkeit der extrazellulären Matrix

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit adhärenten Monoschichten menschlicher Endothelzellen auf kollagenbeschichteten Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit.

Zellen auf steiferen Hydrogelen durchlaufen im Vergleich zu weicheren Hydrogelen eine signifikante Reorganisation des Zytoskeletts, wodurch die intrazelluläre Spannung steigt.

Waschen Sie die Zellen mit Medien und fügen Sie gentechnisch veränderte Listeria monocytogenes hinzu – die Expression eines fluoreszierenden Proteins unter dem Promotor des Actin-Assemblierungs-induzierenden Proteins (ActA).

Zentrifuge, um den Kontakt zwischen Zellen und Bakterien zu erleichtern. Inkubieren, um die bakterielle Endozytose zu vermitteln.

Mit Medien waschen. Mit Gentamicin behandeln, um nicht internalisierte Bakterien zu eliminieren. Ausbrüten.

Internatisierte Bakterien setzen porenbildende Toxine frei, die die phagosomalen Membranen stören. Zytosolische Bakterien regulieren die Expression von ActA und fluoreszierenden Proteinen hoch und markieren intrazelluläre Bakterien.

ActA-Proteine induzieren die Aktinpolymerisation und bilden einen Aktin-Kometenschweif, der die Bakterien vorantreibt, die Internalisierung durch benachbarte Zellen bewirkt und die Verbreitung fördert.

Verwenden Sie nach der Inkubation farbstoffhaltige Medien, um Zellkerne zu färben. Ersetzen Sie Medien durch Medien, die Gentamicin enthalten.

Führen Sie eine Zeitraffermikroskopie durch.

Weichere Hydrogele fördern die schnelle interzelluläre Ausbreitung von Bakterien im Vergleich zu steiferen Hydrogelen mit erhöhter intrazellulärer Spannung, was auf eine von der Matrixsteifigkeit abhängige bakterielle Ausbreitung hindeutet.

Nach der Vorbereitung einer Übernachtkultur von L. monocytogenes gemäß dem Textprotokoll wird 1 Milliliter der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 2.000 g und Raumtemperatur 4 Minuten lang geschleudert. Nachdem Sie das Pellet zweimal mit PBS in Gewebekulturqualität gewaschen haben, verwenden Sie 1 Milliliter PBS, um das Pellet zu resuspendieren.

Bereiten Sie die Infektionsmischung vor, indem Sie 10 oder 50 Mikroliter der Bakteriensuspension mit 1 Milliliter MCDB-131 Vollmedium kombinieren, um eine Vielzahl von Infektionen (MOI) von etwa 50 Bakterien pro Wirtszelle oder 10 Bakterien pro Wirtszelle zu erreichen. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 24-Well-Platten und achten Sie darauf, die Hydrogele oder die Zellen nicht zu beschädigen.

Verwenden Sie 1 Milliliter MCDB-131 Vollmedium, um die Zellen einmal zu waschen, und geben Sie dann 1 Milliliter der Bakterien in jede Vertiefung. Legen Sie den Deckel auf die Teller und wickeln Sie sie mit Polyethylenfolie ein, um ein Auslaufen zu vermeiden. Zentrifugieren Sie die Platten 10 Minuten lang bei 2.000 x g, um die Invasion zu synchronisieren. Inkubieren Sie die Kulturen dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Proben mit dem vollen Medium MCDB-131 4 Mal und geben Sie sie in den Gewebekultur-Inkubator zurück. Ersetzen Sie das Medium nach weiteren 30 Minuten durch MCDB-131 Vollmedium, das mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin ergänzt wird.

Nach der Aussaat von HMEC-1-Zellen auf PA-Hydrogelen und der Behandlung mit Gentamicin gemäß dem Textprotokoll inkubieren Sie die Platte fünf Stunden lang, damit sich der ActA-Promotor einschalten und die Expression des offenen mTagRFP-Leserahmens steuern kann.

Mischen Sie vier Stunden nach der Infektion 1 Mikroliter 1 mg/ml Hoechst-Farbstoff mit 1 Milliliter L15-Vollmedium und geben Sie es in jede Vertiefung, um die Zellkerne zu färben. Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang inkubiert haben, ersetzen Sie das Medium durch 1 Milliliter L15-Vollmedium, das mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin ergänzt wird.

Bilde alle 5 Minuten mehrere Positionen mit einer Autofokus-Funktion ab, um zu überwachen, wie sich LM-Bakterien durch HMEC-1-Monoschichten ausbreiten, die auf Hydrogelen mit unterschiedlicher Steifigkeit ausgesät wurden.