Warum bestätigt die Plaque-Reduktion die antivirale Wirksamkeit in diesem Assay?

Eine Abnahme der Plaque-bildenden Einheiten weist darauf hin, dass das antivirale Medikament die virale Replikation, Ausbreitung oder beides hemmt und liefert somit einen direkten Nachweis der Wirksamkeit. Mithilfe dieses Parameters lässt sich die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch eine Dosis-Wirkungs-Analyse quantifizieren.

Wie verbessert die serielle Verdünnung die Genauigkeit der Virus-Titer-Bestimmung?

Die serielle Verdünnung stellt sicher, dass einzelne Virionen jeweils nur eine Zelle infizieren, wodurch Überlappungen vermieden und die Bildung separater Plaques ermöglicht wird, was eine genaue Zählung erlaubt. Sie ermöglicht die Hochrechnung der Titer aus zählbaren Verdünnungen auf die ursprüngliche Probe.

Welche quantitativen Ergebnisse ermöglichen die Einordnung der antiviralen Wirksamkeit?

Die Umrechnung der Plaque-Anzahl pro Mulde in Plaque-bildende Einheiten pro Milliliter (PFU/mL) liefert eine quantitative Messgröße für die infektiöse Virus-Titer. Der Vergleich der PFU/mL zwischen behandelten und unbehandelten Proben zeigt eine durch das Medikament verursachte Verringerung der Viruslast auf.

Warum sind Replikationsanforderungen wichtig für die Gültigkeit eines Assays?

Die Durchführung von Experimenten im Dreifachansatz gewährleistet statistische Zuverlässigkeit und berücksichtigt biologische Variabilität in Gewebeproben und Viruspräparationen. Eine konsistente Reduktion der Plaques über die Ansätze hinweg erhöht das Vertrauen in die antivirale Wirksamkeit.

Welche statistische Analyse ist vor der Interpretation der Plaque-Assay-Ergebnisse erforderlich?

Die Ergebnisse erfordern die Berechnung des Mittelwerts und der Standardabweichung aus dreifachen Plaque-Zählungen, um die Variabilität zu beurteilen. Eine signifikante Reduktion der PFU/mL im Vergleich zur Kontrolle, typischerweise mittels t-Test oder ANOVA bewertet, bestätigt die antivirale Wirkung.

Bestimmung der antiviralen Wirksamkeit experimenteller Arzneimittel durch einen Plaque-Assay

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 Ansichten • 2:48 Min. • July 8th, 2025

Beginnen Sie mit einer virushaltigen Probe aus einer infizierten Schweinehornhaut, die mit einem antiviralen Arzneimittel behandelt wurde.

Führen Sie eine serielle Verdünnung der Probe durch, um eine Sequenz abnehmender Viruskonzentrationen zu erstellen.

Eine optimale Verdünnung verhindert eine Einzelzellinfektion durch mehrere Viren.

Die verdünnten Proben werden in eine Wirtszell-Monoschicht gegeben und inkubiert.

Das Virus heftet sich an den Rezeptor der Wirtszelle, dringt in die Zelle ein und leitet deren Replikation ein. Die infizierte Zelle lysiert und setzt Virionen frei.

Fügen Sie Methylcellulose hinzu, eine viskose Substanz, die die Viren auf die nahe gelegenen Zellen beschränkt.

Anschließend verursachen die Viren den Zelltod und die Plaquebildung in der infizierten Region.

Fügen Sie Methanol hinzu, um die Zellen zu fixieren.

Verwenden Sie Kristallviolett, um die lebenden Zellen zu färben.

Beobachten Sie Plaques als klare Zonen, die auf infizierte Zellen und Zelltod hinweisen, umgeben von kristallviolett gefärbten, nicht infizierten Zellen.

Zählen Sie schließlich die Anzahl der Plaques bei der höchsten Verdünnung, um den Virustiter in der Ausgangslösung zu quantifizieren und die Wirksamkeit des antiviralen Arzneimittels zu bestimmen.

Um die Menge des von jeder Hornhaut gesammelten Viruses zu quantifizieren, bereiten Sie eine log_10-facheVerdünnung des Virus in serumfreiem Medium in Mikrozentrifugenröhrchen vor, bis eine Verdünnung von 1 x ^10-8 erreicht ist.

Nachdem Sie das Wachstumsmedium aus jeder Zellverdünnung aspiriert haben, übertragen Sie 1 Milliliter jeder Virusverdünnung, beginnend bei 1 x ^10-3, auf die plattierten Zellmonoschichten und legen Sie die infizierten Zellen für zwei Stunden in den Zellkultur-Inkubator. Waschen Sie am Ende der Inkubation jede Vertiefung vorsichtig 2 Mal mit PBS, bevor Sie 2 Milliliter methylcellulosebeladenes Medium für eine 72-stündige Inkubation in jede Vertiefung geben oder bis die Bildung von Plaques beobachtet werden kann.

Nach der Plaque-Beobachtung geben Sie langsam 1 Milliliter Methanol in die Ecke jeder Vertiefung für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation saugen Sie den Inhalt langsam aus jeder Vertiefung ab, ohne die Zellmonoschicht zu stören.

Beschriften Sie anschließend jede Vertiefung mit 1 Milliliter Kristallviolett-Arbeitslösung und achten Sie darauf, dass alle Zellen für eine 30-minütige Inkubation vor Licht geschützt sind. Entsorgen Sie am Ende der Inkubation die Lösung und trocknen Sie die Vertiefungen auf einem Blatt saugfähigem Papier. Zählen Sie dann die Anzahl der Plaques in der höchsten Verdünnungsvertiefung, um den Gesamtvirusgehalt in der Ausgangslösung 3 Mal zu quantifizieren.